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胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum,Pcc)和黑胫果胶杆菌(P.atrosepticum,Pba)是果胶杆菌属(Pectobbacterium)中重要的植物病原菌。因果胶杆菌属属内亚种复杂,寄主范围多样,引起的细菌性软腐病和黑胫病在目前生产上仍缺乏有效的防治措施。因此,研究Pcc和Pba等软腐病原菌的致病机制,能够为制定有效的防控细菌性软腐病和黑胫病提供科学依据,具有重要的理论和实践意义。ED(Entner-Doudo roff)途径是细菌中重要的糖类代谢途径,主要代谢底物为葡萄糖酸。2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸(KDPG)醛缩酶(Eda)和6-磷酸葡萄糖酸脱水酶(Edd)为ED途径的关键酶。实验室前期研究发现ED途径对Pcc和Pba的致病性并不是必需的,而ED途径中的Eda与致病相关,Eda对Pba的致病性的影响主要是通过影响Pba在侵染过程中对果胶的利用。为了进一步阐明Pcc和Pba中ED途径的功能,本研究对ED途径中的edd和eda从生物学上进行了分析。通过基因组分析发现,Pcc缺少edd,不具有完整的ED途径,而Pba具备完整的ED途径。为了探究Eda和Edd对Pcc和Pba碳源的利用的影响,本研究测定了 SCRI 1039、SCRI 1039Δedd、PccS1、PccS1(eddPda)和 PccS1(pBBR)在常规培养基(MM+0.2%葡萄糖酸和MM+0.2%丙酮酸)中生长情况,并对PccS1、PccS1Δeda、SCRI 1039、SCRI 1039Aeda 和 SCRI 1039Aedd进行了 BIOLOG 测试。结果表明:缺少edd的SCRI 1039Δedd、PccS1和PccS1(pBBR)菌株无法利用葡萄糖酸,而具有edd的SCRI 1039菌株可以利用葡萄糖酸,PccS1(edcPba)菌株则可以部分恢复PccS1菌株利用葡萄糖酸的能力。同时,eda相关菌株对BIOLOG中71种碳源的利用情况有所差异,其中,对果胶、D-半乳糖醛酸和D-葡糖酸3种碳源的利用能力差异显著,菌株PccS1 Δeda和SCRI 1039Δeda对果胶和D-葡糖酸利用能力均降低,无法利用D-半乳糖醛酸,表明eda在Pcc和Pba果胶代谢过程中具有关键作用。利用PROSITE蛋白质家族及结构域数据库序列比对分析PccS1菌株中Eda蛋白序列发现:Eda蛋白有两个结构域,活性位点位于一个结构域的末端。为了进一步研究Eda不同结构域在致病过程中的功能,本研究利用载体互补的方法将菌株PccS1中Eda的两个结构域回补至PccS1Aeda,得到了菌株PccS1Aeda(eddal-FLAG)和PccS1Δeda(eda2-FLAG)。Western blot结果显示,回补的Eda单一结构域均能够正常表达。在大白菜和黄花马蹄莲上进行的致病性测定结果显示,回补单一结构域均未恢复突变体致病性减弱的表型,而PccS1 Δeda(eda)互补菌株致病力恢复,以上结果说明Eda的两个结构域在PccS1的致病过程中缺一不可。为了进一步探究Eda如何影响果胶杆菌属细菌致病性的调控机理,本研究对PccS1、PccS1 Aeda、SCRI1039和SCRI 1039Aeda进行了转录组测序分析。结果表明:PccS1 Aeda与PccS1相比,11个基因上调,6个基因下调,差异表达基因主要集中在碳代谢、丙酮酸盐代谢、戊糖磷酸途径及二羧酸代谢中;SCRI 1039Aeda与SCRI 1039相比,上调基因数为407,下调基因数为316,差异表达基因数目在碳代谢、鞭毛组装、淀粉和蔗糖代谢及柠檬酸循环(TCA循环)中居多。由此可见,PccS1和SCRI 1039的eda对碳代谢影响较大,说明eda在碳代谢中具有重要的作用。此外,对分析结果中与碳代谢调控有关的转录调控子hexR进行了基因敲除,致病性测定结果显示,ΔhexR对致病力没有影响。综上所述,Pectobacterium中ED途径是代谢葡萄糖酸的唯一途径,eda与Pcc和Pba的果胶代谢和葡萄糖酸的利用均相关。同时,Eda的致病相关调控网络与碳代谢密切相关。