论文部分内容阅读
[目 的]甲基苯丙胺（Methamphetamine,METH）已经取代传统毒品海洛因成为我国使用人数最多的毒品。METH可导致全身各器官、系统的损害。目前大部分METH损伤研究主要在神经系统,消化系统损伤研究极少。据临床病案报道,METH导致消化道炎症、溃疡、穿孔、出血、梗阻,并发肠源性感染等疾病。我们前期构建了 METH依赖的恒河猴模型,肠道组织苏木素-伊红染色显示肠壁变薄,结构不清,炎性细胞浸润,肠黏膜糜烂伴溃疡形,弥漫性绒毛变性、坏死,提示METH导致肠道损伤。有研究表明,METH通过产生肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）减少血管内皮紧密连接蛋白的表达,从而对血脑屏障产生毒性作用。然而,METH导致的肠黏膜屏障损伤机制研究却寥寥无几。基于此,本研究通过检测METH依赖者的临床特征和外周血肠损伤标记物、促炎因子TNF-α的表达,结合TNF-α在肠上皮细胞分子生物学实验,明确METH对肠道的损伤及损伤机制。研究促炎因子TNF-α在METH导致肠黏膜损伤中的作用,并进一步研究TNF-α上游的调控机制,为METH导致肠黏膜屏障损伤研究提供证据和新的思路。[方 法]1.在临床研究上,筛选了强制戒毒所中METH依赖者207人,其中男性193名,女性14名。采集患者一般信息和全血,血液样本用于血细胞分析、生化、肠黏膜损伤生物标志物检测和促炎因子TNF-α表达情况检测。分析METH依赖者肠黏膜屏障损伤标志物与METH依赖史、TNF-α之间的相关性。2.在细胞实验方面2.1构建细胞模型:METH处理正常大鼠肠上皮细胞IEC-6,跨膜电阻（TEER）测量仪检测不同浓度不同时间METH对肠上皮屏障的影响,CCK8检测细胞增殖活力的变化。2.2 METH造成肠屏障损伤:流式细胞仪检测METH导致细胞凋亡情况;RT-qPCR、ELISA 法及 western blotting 技术检测 METH 对上皮细胞 TNF-α,MLCK,ZO-1基因及蛋白表达的影响。2.3验证TNF-α在METH肠屏障损伤中的作用:构建TNF-α（GenBank序列NM012675）过表达/干扰质粒并转染细胞。考查TNF-α基因过表达及沉默对METH损伤肠上皮屏障通透性改变的影响,检测TNF-α、MLCK、ZO-1基因及蛋白表达情况。2.4 TNF-α上游的调控机制:在TargetScan,miRDB和microRNA数据库中筛选靶向TNF的mircoRNAs。RT-qPCR检测相关mircoRNA在METH处理的IEC-6细胞中的表达。双荧光素酶报告基因检测实验,RT-qPCR及Western blotting技术验证miR-181c-5p与TNF-α的靶向关系。2.5阐明miR-181c-5p在METH导致的肠上皮屏障损伤中的作用:在METH细胞模型上检测肠屏障损伤的表型（TEER、CCK8）。流式细胞仪、RT-qPCR、ELISA法及western blotting技术检测miR-181 c-5p对肠黏膜屏障的影响及miR-181c-5p对常见的炎症因子IFN-γ、IL-1β、IL-8的影响。[结果]1.临床研究结果与正常健康人群相比,METH依赖者血清肠黏膜屏障损伤生物标志物二胺氧化酶（DAO）,D-乳酸（DLC）和内毒素（BT）较健康对照人群显著升高,P<0.0001,差异有统计学意义。METH依赖者血清TNF-α表达水平较正常对照人群明显增高。TNF-α水平增高与DLA水平（P=0.001）正相关。同时,我们发现METH依赖者出现厌食（12.56%vs 1%）、腹痛（18.84%vs 3%）、腹胀（7.25%vs 0.5%）、便秘（17.39%vs 5.5%）、腹泻（7.25%vs 2%）、消化道出血（2.89%vs 0%）的症状和肠鸣音异常（30.43%vs2.5%）的表现显著增多;外周血红细胞计数、血红蛋白、白蛋白含量降低;炎症指标中C反应蛋白、白细胞和血小板计数、中性粒细胞百分比增多;全血免疫指标中淋巴细胞百分比降低,嗜碱性粒细胞百分比增多,流式细胞仪检测到NK细胞占总淋巴细胞的百分比也降低。METH依赖者身体质量指数BMI低于正常对照组。2.细胞实验结果2.1随着METH浓度增高和METH处理IEC-6细胞时间延长,肠上皮屏障跨膜电阻和细胞增殖活力逐渐降低。METH 0.25mM/L处理细胞48小时,TEER显著降低,细胞增殖活力亦明显降低;2.2 METH促进肠上皮细胞的凋亡,增加促炎因子TNF-α、肌动蛋白激酶MLCK和减少紧密连接蛋白ZO-1的表达导致肠上皮屏障的损坏;2.3过表达TNF-α使肠上皮屏障跨膜电阻降低,MLCK的基因和蛋白表达增加,ZO-1表达下降;干扰TNF-α具有相反的作用。TNF-α参与了 METH致肠上皮黏膜屏障损伤的过程;2.4从数据库中筛选到8个microRNAs靶向调控TNF-α。其中,mo-miR-181c-5p在METH细胞模型中表达降低。双荧光素酶报告基因检测实验和过表达miR-181c-5p使TNF-α基因及蛋白表达均降低,证实了miR-181c-5p和TNF-α的靶向关系。2.5过表达miR-181c-5p部分拮抗METH导致的肠屏障跨膜电阻的降低和细胞增殖活力的下降;减少肠上皮细胞的凋亡,降低TNF-α、MLCK的表达,增加ZO-1的表达;并且降低了炎症因子IFN-γ、IL-1β、IL-8的释放。miR-181c-5p参与调控TNF-α介导的METH所导致的肠上皮黏膜屏障损伤。[结论]1.METH依赖者消化道症状较正常人显著增多,血清肠损伤生物标志物检测指标显著升高;2.METH依赖者血清中促炎因子TNF-α的释放增加,并与DLA水平呈正相关;3.TNF-α参与了 METH导致的肠损伤,其机制是通过TNF-α/MLCK/ZO-1轴破坏肠上皮黏膜屏障;4.miR-181c-5p靶向调节TNF-α并参与细胞凋亡、紧密连接破坏过程,是引起METH肠道黏膜屏障损伤的原因之一。