日本血吸虫Pumilio基因生殖发育功能的初步研究

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目的:了解血吸虫的生殖调控对于预防和治疗血吸虫病至关重要。Pumilio在许多物种的生殖发育过程起调节作用,但在血吸虫中的作用还未知,本文对日本血吸虫Pumilio2(Pum2)基因在日本血吸虫中的功能,尤其是在生殖器官发育中的功能和作用进行初步研究。  方法:首先扩增获得了日本血吸虫Pumilio1(SjPum1)和Pumilio2(SjPum2)基因全长序列,并使用DNAMAN等软件对其序列进行分析;用荧光定量PCR(qPCR)的方法检测了SjPum1和SjPum2的mRNA在血吸虫生活史不同时期和血吸虫不同部位的表达量;选择Pum2基因进行进一步的功能研究。通过原位杂交的方法,明确Pum2基因在日本血吸虫的定位;随后,用针对Pum2基因的小干扰RNA来消减Pum2基因,通过激光共聚焦显微镜观察该基因消减后日本血吸虫生殖器官的形态改变,并使用普通光学显微镜观察日本血吸虫虫卵数量的变化;最后,用qPCR方法检测了与凋亡相关基因表达水平的变化。  结果:通过PCR成功扩增了长2613 bp的SjPum1和长4479 bp的SjPum2,分析表明,日本血吸虫的Pum1和Pum2蛋白属于PUF家族;qPCR结果显示SjPum1和SjPum2的mRNA的表达量在42天雌虫中较高,并且SjPum1和SjPum2主要表达在日本血吸虫的生殖器官如睾丸和卵巢中;我们把SjPum2作为进一步的研究对象,主要观察其对生殖功能的影响。原位杂交的结果显示,SjPum2基因主要在日本血吸虫卵巢和睾丸中有阳性信号;激光共聚焦结果表明,SjPum2基因消减后,日本血吸虫雌雄虫生殖器官的形态均发生改变,同时,子宫中的虫卵也减少;对培养基中的虫卵进行计数,发现SjPum2基因消减后,雌虫产卵量也明显下降;此外,SjPum2基因沉默也影响了与血吸虫细胞凋亡相关的基因的表达,如Caspase-3、Caspase-7等基因。  结论:该实验成功扩增出日本血吸虫Pum1和Pum2基因的全长,并通过实验分析表明,Pum1和Pum2基因在日本血吸虫的各期均有表达,且主要表达在血吸虫的生殖器官中,雌虫中表达量高于雄虫。进一步对SjPum2基因进行消减,发现血吸虫雌虫和雄虫生殖器官形态均发生明显的变化,并且雌虫的产卵量也受到影响。故我们得出结论,SjPum2基因影响了日本血吸虫生殖器官的发育,同时,SjPum2也可能和日本血吸虫的细胞凋亡相关。
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