背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。近年来,由于包括饮食习惯等生活方式的改变,乳腺癌在我国的发病率呈明显上升趋势,居女性恶性肿瘤的第二位,不但严重影响了女性的身体健康,而且死亡率高。虽然目前临床使用的抗肿瘤药物有很多种,但多数药物在治疗癌症的过程中仍存在抗药性等局限性,因此,深入研究新抗癌药物敏感的肿瘤类型和抗癌机制,仍然是当前肿瘤研究的重要课题。5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine, DAC)是一种表观遗传抗癌药物,美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准DAC可用于骨髓增生异常综合征和白血病治疗。DAC对实体瘤也有作用,初步临床试验表示DAC对乳腺癌和非小细胞肺癌等有一定抗肿瘤作用,但和其对白血病的效应相比,DAC对实体瘤的治疗作用比较有限,不过体外实验表明,DAC对实体瘤细胞有细胞毒性,而且某些肿瘤细胞对DAC比较敏感,因此,DAC仍有可能用于治疗某些类型的实体瘤。DAC抗癌机制可以依赖于DNA去甲基化作用,也可以不依赖DNA去甲基化作用。前者与DAC直接抑制DNA甲基转移酶,激活抑癌基因表达有关,后者则可能通过诱导癌细胞DNA损伤。自噬是普遍存在于真核细胞的一种生物现象,是细胞在某些刺激因素下,如DNA损伤、营养缺乏和缺氧等情况下,细胞内膜性结构包绕损伤的蛋白或细胞器,并通过与溶酶体融合降解损伤的蛋白或细胞器的过程,降解产物可被循环利用。自噬是细胞在不利的生长环境下的应激反应。因刺激的差异,自噬既可对细胞起保护作用,也可导致细胞死亡。自噬在乳腺癌的发生和治疗中起重要作用。研究认为,在尚未发生侵袭的乳腺癌发病早期,肿瘤细胞能够利用自噬来克服低氧、营养剥夺的环境,进而延迟凋亡,增强自身存活能力。在肿瘤细胞对抗癌药物的反应中,自噬既起到保护肿瘤细胞的作用,也可起到促进肿瘤细胞死亡的作用。抗癌药物依托泊甙可诱导肿瘤细胞自噬,和自噬抑制剂联用可增强能得到更好的效果。有研究表明DNA损伤可以引起细胞自噬,但抗癌药物导致的癌细胞DNA损伤是否和自噬相关却研究很少。所以,在此项研究中我们先观察了DAC对乳腺癌细胞自噬的影响,然后进一步研究了自噬和其细胞毒性的关系。这一研究加深了对DAC抗癌机制的了解,并将为其临床应用提供进一步的理论基础。目的研究DAC对不同乳腺癌细胞系自噬的影响,研究DAC诱导的自噬是否与其诱导的DNA损伤相关；DAC诱导的自噬是促进细胞增殖还是抑制细胞增殖；DAC是通过影响细胞周期、还是细胞凋亡来影响细胞增殖。方法以DAC处理MDA-MB-468、MCF-7和T-47D三种乳腺癌细胞系,检测DAC对乳腺癌细胞DNA损伤、自噬、增殖、细胞周期和凋亡的影响。为研究DAC诱导的乳腺癌细胞DNA损伤与自噬的因果关系,先观察了依托泊甙和顺铂对MDA-MB-468、MCF-7和T-47D三种乳腺癌细胞DNA损伤和自噬的影响。因为普遍认为,依托泊甙和顺铂的抗癌机制与其对癌细胞的DNA损伤有关,而DNA损伤可诱导细胞自噬,因此,如果依托泊甙和顺铂导致的细胞DNA损伤与自噬相关的话,则药物诱导的DNA损伤和自噬有因果关系。同理,如果DAC同时诱导的乳腺癌细胞DNA损伤与自噬,则DAC诱导的DNA损伤和自噬有因果关系。用彗星实验检测细胞DNA损伤,并用免疫印迹法检测p53、p21蛋白表达变化来验证细胞DNA损伤对p53通路的影响。用三种方法检测细胞自噬,包括免疫印迹法检测LC3蛋白变化、丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine, MDC)染色和转染pEGFP-LC3质粒。多种检测方法的联合使用保证了实验结果的可靠性。用噻唑蓝(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)实验检测细胞活力,通过细胞活力的变化计算细胞增殖率。用自噬抑制剂巴佛洛霉素Al (Bafilomycin Al, BA1)、3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3MA)、渥曼青霉素(Wortmannin, WM)或NH4Cl四种不同的自噬抑制剂分别与DAC联用,通过和DAC单独处理组细胞增殖率进行比较,观察自噬细胞增殖的影响。用流式细胞仪检测细胞周期。用Annexin V试剂盒检测细胞凋亡。结果和对照组相比,依托泊甙和顺铂处理组可以引起乳腺癌细胞MDA-MB-468、MCF-7和T-47D彗星长度增加,二组间差异均具有统计学意义。MDA-MB-468对照组、依托泊甙组和顺铂组彗星长度分别为65.939±11.753μm,142.788±16.575μm,186.121±37.612μm(F=336.220, P=0.000); MCF-7对照组、依托泊甙组和顺铂组彗星长度分别为43.879±5.237μm,77.818±12.963μm,69.576±17.825μm (F=146.013, P=0.000); T-47D对照组、依托泊甙组和顺铂组彗星长度分别为55.152±7.755μm,154.333±24.762μm,153.182±24.979μm(F=284.347, P=0.000)。p53和p21蛋白上调,说明抗肿瘤药物依托泊甙和顺铂可以引起乳腺癌细胞DNA损伤；依托泊甙和顺铂处理的乳腺癌细胞MDA-MB-468、MCF-7和T-47D细胞LC3-Ⅱ蛋白升高,说明依托泊甙和顺铂可以诱导乳腺癌细胞自噬。DAC可以引起乳腺癌细胞MDA-MB-468、MCF-7和T-47D彗星长度增加,处理组与对照组相比,差异均具有统计学意义,MDA-MB-468对照组和DAC处理组彗星长度分别为65.939±11.723μm,194.667±27.882μm (t=-24.439, P=0.000); MCF-7对照组和DAC处理组彗星长度分别为43.879±5.237μm,86.818±15.288μm (t=-15.264, P=0.000); T-47D对照组和DAC处理组彗星长度分别为55.152±7.755μm,76.000±16.668μm (t=-6.515, P=0.000)。p53和p21蛋白上调,说明DAC对于乳腺癌细胞能够造成乳腺癌细胞DNA损伤。DAC可以升高乳腺癌细胞MDA-MB-468、MCF-7和T-47D LC3-Ⅱ蛋白；用MDC染MCF-7细胞,计数阳性细胞个数,发现DAC处理组MDC阳性细胞显著增加,和对照组相比,差异有统计学意义。对照组和DAC处理组阳性细胞率分别为26.24±11.46%,58.30±6.72%(t=-6.057, P=0.000);用DAC处理转染pEGFP-LC3的MCF-7细胞,绿色荧光蛋白斑阳性细胞显著增加,和对照组相比,差异具有统计学意义。对照组和DAC处理组阳性细胞率分别为35.096±2.898%,55.109±3.896%(t=-8.234, P=0.000)说明DAC可以诱导乳腺癌细胞自噬。用MTT检测对照组和DAC处理组乳腺癌细胞MDA-MB-468、MCF-7和T-47D的细胞活力。DAC在100nmol/L浓度时显著抑制MDA-MB-468细胞增殖,对照组和DAC处理组细胞增殖率分别为101.222±3.735%,78.917±3.093%(t=19.516,P=0.000),但同样浓度不能引起MCF-7和T-47D细胞生长抑制,MCF-7对照组和DAC处理组细胞增殖率分别为100.833±4.288%,92.811±13.099%(t=2.469, P=0.119), T-47D对照组和DAC处理组细胞增殖率分别为100.167±6.270%,98.468±11.916%(t=0.535, P=0.596).用自噬抑制剂BA1、3MA、WM和NH4Cl预处理乳腺癌细胞MDA-MB-468、MCF-7和T-47D,再用DAC处理。BA1预处理后可增强DAC对三种细胞系的增殖抑制。BA1与DAC联用处理MDA-MB-468、MCF-7和T-47D,细胞增殖率分别为67.733±4.048%,65.254±7.433%,74.421±6.042%(P=0.000);3MA预处理可增强DAC对MDA-MB-468和MCF-7增殖抑制,但不可增强DAC对T-47D的增殖抑制；WM组和NH4Cl预处理可增强DAC对MDA-MB-468的增殖抑制,对MCF-7和T-47D无效果。这表明,DAC与自噬抑制剂BA1、3MA或WM联用可以增加DAC对乳腺癌细胞的生长抑制,但不同抑制剂效果不同。DAC处理后的乳腺癌细胞MDA-MB-468出现G2/M阻滞,MDA-MB-468对照组和DAC处理组G2/M期细胞百分比分别为11.887±2.650%,28.020±1.495%(P<0.05)；自噬抑制剂BA1可增强DAC导致的MDA-MB-468G2/M阻滞,DAC处理组和BA1与DAC联用处理组G2/M期细胞百分比分别为28.020±1.495%,36.907±3.003%(P<0.05)。DAC可以轻度引起乳腺癌细胞MDA-MB-468细胞凋亡,MDA-MB-468对照组和DAC处理组细胞凋亡率分别为11.255±2.943%,15.254±2.578%(P<0.05)；自噬抑制剂BAl预处理后对DAC诱导的细胞凋亡无影响,BA1与DAC联用处理组细胞凋亡率为15.312±1.503%。结论DAC可以同时引起乳腺癌细胞DNA损伤,后者可导致乳腺癌细胞自噬。DAC对不同乳腺癌细胞的细胞毒性作用不同,提示DAC可能只会对部分乳腺癌的治疗有效。DAC与自噬抑制剂联用可以加强DAC对乳腺癌细胞的细胞毒性作用,提示DAC诱导的自噬对乳腺癌细胞起保护作用。DAC可以引起乳腺癌细胞MDA-MB-468G2/M期阻滞,说明DAC抑制MDA-MB-468增殖与DAC抑制MDA-MB-468的G2/M期有关。DAC与自噬抑制剂BA1联用后乳腺癌细胞G2/M期阻滞增加,说明自噬可能通过促进细胞周期中的G2/M期进行而保护细胞。DAC只能够引起MDA-MB-468的轻度凋亡,说明DAC对MDA-MB-468的增殖抑制主要不是DAC诱导凋亡,而是抑制G2/M细胞周期。与DAC组相比,DAC与BA1联用处理MDA-MB-468,细胞凋亡没有增加,说明自噬与DAC引起的细胞凋亡无关。综上所述,DAC可以诱导乳腺癌细胞DNA损伤和自噬,DNA损伤可能是自噬的原因之一,自噬在DAC的细胞毒性中起保护作用,自噬抑制剂和DAC联用可增强DAC对某些乳腺癌的治疗效果。