目的：目前我国肾脏疾病，尤其是糖尿病肾病(DN)的发病率不断上升。DN是糖尿病患者最严重的并发症之一，其发展至晚期往往会导致终末期肾功能衰竭，严重威胁人类的健康。DN的发病机制非常复杂，涉及到遗传、代谢、生长因子、细胞因子等多种因素。随着研究的不断深入，人们发现肿瘤坏死因子α(TNF-α)可能为参与糖尿病肾病发生、发展的一个不可忽视的关键性细胞因子。在DN动物模型和DN患者中，TNF-α的表达水平均有升高，提示TNF-α参与了DN的发生与发展。TNF-α由157个氨基酸构成，除造血细胞外，肾脏固有细胞（主要是系膜细胞、肾小球细胞和肾小管上皮细胞等）也可产生TNF-α。TNF-α具有广泛的生物学活性，与细胞的分化、增殖及凋亡有关。有实验表明，TNF-α可以诱导负鼠肾脏近端肾小管上皮细胞发生凋亡。但有关TNF-α能否诱导人肾近端肾小管上皮细胞发生凋亡的研究却鲜见报道。　　 Janus激酶/转录激活因子（JAK/STAT）信号途径是细胞因子信号转导的重要通路之一，在肾脏疾病的发生发展中起重要作用。STAT是JAK激酶的底物，与酪氨酸磷酸化信号通路耦联，从而发挥转录调控作用。细胞因子信号转导抑制蛋白(SOCS)家族是一类由细胞产生、可反馈性阻断细胞因子信号转导过程的负性调节因子，其对JAK/STAT信号通路起负调控作用。SOCS可能通过抑制JAK/STAT信号对DN发挥保护作用。现在尽管已经证实TNF-α诱导的细胞凋亡与JNK及NF-κB两条细胞信号转导通路密切相关，但对于JAK/STAT信号通路是否也在其中发挥一定的作用以及SOCS-1干预后能否抑制TNF-α诱导的细胞凋亡等问题却知之甚少。　　 因此，本实验着重观察了TNF-α对人肾近端肾小管上皮细胞(HKC)凋亡和JAK/STAT信号激活的影响以及JAK/STAT信号特异性阻断剂(AG490)和SOCS-1过表达对TNF-α诱导细胞凋亡和JAK/STAT通路的影响。初步探讨TNF-α诱导HKC凋亡及凋亡过程中JAK/STAT信号通路的激活和SOCS-1基因的作用等问题，以期为DN的防治提供新的依据和策略。　　 方法：　　 1、材料：人肾近端肾小管上皮细胞株HKC;pCR3.1-SOCS-1稳定转染人肾近端肾小管上皮细胞细胞系；pCR3.1-vector空质粒稳定转染人肾近端肾小管上皮细胞细胞系；TNF-α;AG490。　　 2、方法　　 2.1用甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定HKC细胞株的增殖情况，以确定TNF-α的半数抑制浓度(IC50):设立空白对照组（control）、溶剂对照组(solvent)、药物组；药物浓度为5ng.ml-1，10ng.ml-1，20ng.ml-1，40ng.ml-1，80ng.ml-1，160ng.ml-1。作用时间：24h，测定IOD值，计算细胞生长抑制率，根据公式确定IC50，作为本实验中TNF-α的刺激浓度。　　 2.2实验分组：实验细胞分成5组，分别为：对照组(N);TNF-α组(T);TNF-α+AG490组(T+A)；TNF-α+pCR3.1-SOCS-1转染组(T+S1)；TNF-α+pCR3.1-vector空质粒转染组(T+V)；分别经细胞同步化、分组干预及刺激后收集细胞，进行观察检测。　　 2.3检测指标　　 2.3.1流式细胞定量检测技术(FCM)检测各组细胞凋亡率。　　 2.3.2琼脂糖凝胶电泳(DNA Ladder)检测细胞凋亡。　　 2.3.3末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸-生物素缺口末端标记法(TUNEL)检测各组细胞凋亡率。　　 2.3.4应用蛋白免疫印迹(Western Blot)方法检测各组细胞p-STAT1、p-JAK2蛋白的表达情况。　　 结果：　　 1、TNF-α对HKC细胞株增殖的影响MTT法测定显示：TNF-α作用于HKC细胞24h，IC50为18.59ng.mL-1。TNF-α对HKC细胞的增殖有抑制作用，并且随着药物浓度的升高，抑制作用逐渐增强。当药物浓度达到160ng.mL-1时，TNF-α的抑制率接近80％。溶剂对细胞的生长未见明显影响。　　 2、TNF-α诱导HKC凋亡及其对p-STAT1、p-JAK2蛋白表达的影响：FCM、DNA Ladder、 TUNEL等检测显示：与对照组相比，TNF-α刺激HKC6h后凋亡率显著增加，12h达到高峰，之后逐渐回落，但仍高于对照组。Western Blot结果表明，与对照组相比，TNF-α刺激后HKC中p-STAT1和p-JAK2蛋白表达升高，以刺激12h时表达最高，而后回落，但仍高于对照组。　　 3、AG490对TNF-α诱导的HKC凋亡和p-STAT1、p-JAK2蛋白表达的影响：FCM、DNA Ladder、 TUNEL等结果显示：与同期T组相比，T+A组的凋亡率显著下降，但仍高于对照组。Western Blot结果表明，与同期T组相比，T+A组p-STAT1、p-JAK2蛋白的表达显著降低，但仍高于对照组。　　 4、SOCS-1过表达对TNF-α诱导的HKC凋亡和p-STAT1、p-JAK2蛋白表达的影响：FCM、DNA Ladder、TUNEL等结果显示：与同期T组相比，T+V组的凋亡率无明显差异，而T+S1组的凋亡率则显著下降，但仍高于对照组。Western Blot显示：与同期T组相比，T+S1组p-STAT1和p-JAK2蛋白的表达降低，T+V组两种蛋白的表达与T组相比无显著差异。　　 结论：　　 1、TNF-α对HKC生长的抑制作用呈剂量依赖性，并可诱导其凋亡。经TNF-α作用后，HKC中p-STAT1和p-JAK2蛋白的表达水平升高。AG490干预后能抑制TNF-α诱导的HKC凋亡，并下调HKC中p-STAT1和p-JAK2蛋白的表达水平，提示JAK/STAT信号途径可能参与了TNF-α诱导的HKC凋亡。　　 2、过表达SOCS-1基因能抑制TNF-α诱导的HKC凋亡及p-STAT1和p-JAK2蛋白的表达，提示SOCS-1基因可能通过对JAK/STAT信号途径的负反馈作用抑制TNF-α诱导的HKC凋亡。