前体和真菌诱导子对雷公藤悬浮细胞次生代谢产物合成的影响

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雷公藤(T. wilfordii Hook. f),野生藤本植物。临床应用和药理学分析证明其有抗肿瘤,消炎,免疫抑制等作用,同时研究发现雷公藤也具有明显的杀虫作用。化学和药理分析发现雷公藤有效成分有二萜类、三萜类和生物碱类等化合物。雷公藤中活性物质含量很低,但目前随着需求量急剧增加,自然生长雷公藤难以满足生产需要。组织培养中前体物质和真菌诱导子的添加被证明对次生代谢产物积累有促进作用。基于此,本文在前期基础上就雷公藤悬浮细胞培养过程中前体和诱导子对雷公藤次生代谢产物的影响进行了初步研究。主要研究结果如下:1.异亮氨酸、烟酸、天冬氨酸等前体物质的添加可以促进雷公藤悬浮细胞次生代谢产物的积累。3种前体添加抑制细胞生长。不同前体物质对次生代谢产物的刺激作用不同,且不同处理浓度对目标物的促进作用亦存在差异:(1)仅烟酸0.1mmol/L处理使内酯醇明显增加,是对照的1.29倍;(2)3种前体均可促进吉碱的积累,1.5mmol/L异亮氨酸处理使吉碱比对照高5.58倍,达218.14μg/瓶;天冬氨酸和烟酸的吉碱最大量分别是154.42μg/瓶和183.49μg/瓶;(3)添加异亮氨酸和天冬氨酸可明显促进次碱的积累,分别在1.5mmol/L和1.0mmol/L浓度下,2种处理中次碱含量分别为28.79μg/瓶和11.08μg/瓶;烟酸对次碱的积累则无明显促进作用。2.以雷公藤内生真菌F4-3菌株为试材,筛选得到悬浮细胞中内生真菌诱导子较适宜添加时间是第15天。该时期添加,悬浮细胞培养体系中吉碱和总生物碱含量最高。3. F4-3、F4-31、F4-20等真菌诱导子的添加可以促进雷公藤悬浮细胞次生代谢产物的积累,不同种类诱导子对次级代谢产物的促进作用不同,且各处理浓度对内酯醇,吉碱,次碱的影响存在差异:(1)35mg/L F4-31处理吉碱含量比对照提高3.1倍,达到127.06μg/瓶;50mg/LF4-3处理吉碱比对照增加3.2倍,达到127.88μg/瓶,F4-20处理吉碱比对照高1.83倍,达到74.21μg/瓶。(2)F4-31诱导子50mg/L处理使次碱达到13.846μg/瓶,是对照的2.5倍。F4-3和F4-20处理次碱达11.83μg/瓶和11.98μg/瓶,分别是对照的2.17、2.2倍。(3)仅F4-3诱导子处理使内酯醇增加2.54倍,达到22.67μg/瓶。内生真菌诱导子对细胞生长有抑制作用。4.以雷公藤内生真菌F4-3菌株为试材,测试、分析了真菌诱导子对不同组织细胞系次生代谢产物积累的影响。真菌诱导子对各细胞系内酯醇、吉碱、次碱均有不同程度的促进作用。其中对叶悬浮细胞促进作用最为显著,分别是对照的6,5,6.2倍;根、茎悬浮细胞处理后次生代谢产物分别是对照的1.1,2.5,1.8倍和1.2,2.4,1.4倍。
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