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目的通过观察补肾健脾方对去卵巢所致骨质疏松大鼠骨组织形态、骨力学性能以及大鼠胫骨骨髓中肿瘤坏死因子受体相关因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)、c-Src 激酶(c-Src kinase,c-Src)和活化T 细胞核因子 1(Nuclear factor activated T cell 1,Nfatc1)蛋白表达的影响,探讨补肾健脾方对去卵巢所致骨质疏松大鼠的治疗作用,部分揭示其机理,为临床从脾肾论治骨质疏松症提供科学依据。方法雌性3月龄SPF级SD大鼠66只,体重259±14g,随机分为3组:空白对照组12只,假手术组12只,造模组42只。造模组大鼠麻醉后行双侧卵巢切除手术(Ovariectomize,OVX),假手术组只切除卵巢周围小块的脂肪组织,但不切除卵巢。手术过程中造模组死亡5只大鼠。术后3个月,将剩余37只造模组大鼠随机分为3组:OVX组13只,雌激素组(OVX+戊酸雌二醇)12只,补肾健脾组(OVX+补肾健脾方)12只。并对各给药组大鼠灌胃给药:补肾健脾组给予补肾健脾方药液,给药浓度为1.42g生药/ml,给药体积为1Oml/kg体重,给药剂量为14.2g/kg体重。雌激素组灌胃给予浓度为0.0184mg/ml的戊酸雌二醇溶液,给药体积为10ml/kg体重,给药剂量为0.184mg/kg体重。大鼠灌胃给药每天1次,一周连续6天,休息1天,如此给药3个月。空白对照组、假手术组、OVX组按上法灌胃给予等体积的纯净水。所有大鼠每周称体重一次,据最新体重调整一周给药剂量。给药结束后处死,取大鼠双侧股骨,分别进行骨组织形态及骨生物力学检测;取大鼠胫骨,剔干净骨组织周围软组织,用4%多聚甲醛固定,EDTA脱钙,胫骨近端1/3制作脱钙骨组织冰冻切片,用以检测大鼠胫骨骨髓中TRAF6、c-Src、Nfatc1蛋白表达。实验结果皆以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 20.0统计分析软件进行统计学处理。统计数据需进行正态性及方差齐性检验。正态分布数据两组以上的比较采用单因素方差分析(ANOVA),组间两两比较,方差齐性的数据采用LSD检验;方差不齐的则采用Dunnett’s T3检验。非正态分布数据采用非参数检验。结果1补肾健脾方对去卵巢所致骨质疏松大鼠股骨骨组织形态指标的影响1.1补肾健脾方对去卵巢所致骨质疏松大鼠股骨骨体积分数(BV/TV)的影响OVX组大鼠较假手术组股骨BV/TV显著降低。与OVX组相比,雌激素组和补肾健脾组大鼠股骨BV/TV明显增高,但仍显著低于假手术组。1.2补肾健脾方对去卵巢所致骨质疏松大鼠股骨骨小梁分离度(Tb.Sp)的影响OVX组大鼠较假手术组股骨Tb.Sp显著增高。与OVX组相比,雌激素组和补肾健脾组大鼠股骨Tb.Sp明显降低,但仍显著高于假手术组。1.3补肾健脾方对去卵巢所致骨质疏松大鼠股骨骨小梁数目(Tb.N)的影响与假手术组相比,OVX组大鼠股骨Tb.N显著降低。与OVX组相比,雌激素组和补肾健脾组大鼠股骨Tb.N显著增高,但仍显著低于假手术组。1.4补肾健脾方对去卵巢所致骨质疏松大鼠股骨骨小梁结构模型指数(SMI)的影响与假手术组比,OVX组大鼠股骨SMI显著增高。与OVX组相比,雌激素组和补肾健脾组大鼠股骨SMI明显降低,但仍显著高于假手术组。1.5补肾健脾方对去卵巢所致骨质疏松大鼠股骨骨小梁厚度(Tb.Th)的影响各组大鼠股骨Tb.Th无统计学差异。2补肾健脾方对去卵巢所致骨质疏松大鼠股骨骨生物力学性能的影响2.1补肾健脾方对去卵巢所致骨质疏松大鼠股骨最大载荷的影响与假手术组相比,OVX组大鼠股骨最大载荷显著降低。与OVX组相比,雌激素组和补肾健脾组大鼠最大载荷显著增高,但仍显著低于假手术组。2.2补肾健脾方对去卵巢所致骨质疏松大鼠股骨弯曲强度的影响与假手术组相比,OVX组大鼠股骨弯曲强度显著降低。与OVX组相比,雌激素组和补肾健脾组大鼠股骨弯曲强度明显增高,但仍明显低于假手术组。2.3补肾健脾方对去卵巢所致骨质疏松大鼠股骨弹性模量的影响与假手术组相比,OVX组大鼠股骨弹性模量明显降低。与OVX组相比,雌激素组和补肾健脾组大鼠股骨弹性模量明显增高,且与假手术组无统计学差异。3补肾健脾方对去卵巢所致骨质疏松大鼠胫骨骨髓中TRAF6、c-Src、Nfatc1蛋白表达的影响3.1补肾健脾方对去卵巢所致骨质疏松大鼠胫骨骨髓中TRAF6蛋白表达的影响与假手术组相比,OVX组大鼠胫骨骨髓中TRAF6蛋白表达的阳性密度显著增高。与OVX组相比,雌激素组和补肾健脾组大鼠胫骨骨髓中TRAF6蛋白表达的阳性密度显著降低,雌激素组大鼠胫骨骨髓中TRAF6蛋白表达的阳性密度与假手术组无差异。补肾健脾组大鼠胫骨骨髓中TRAF6蛋白表达的阳性密度仍显著高于假手术组。3.2补肾健脾方对去卵巢所致骨质疏松大鼠胫骨骨髓中c-Src蛋白表达的影响与假手术组相比,OVX组大鼠胫骨骨髓中c-Src蛋白表达的阳性密度显著增高。与OVX组相比,雌激素组和补肾健脾组大鼠胫骨骨髓中c-Src蛋白表达的阳性密度明显降低,雌激素组大鼠胫骨骨髓中c-Src蛋白表达的阳性密度与假手术组无差异。补肾健脾组大鼠胫骨骨髓中c-Src蛋白表达的阳性密度仍显著高于假手术组。3.3补肾健脾方对去卵巢所致骨质疏松大鼠胫骨骨髓中Nfatc1蛋白表达的影响与假手术组相比,OVX组大鼠胫骨骨髓中Nfatc1蛋白表达的阳性密度显著增高。与OVX组相比,雌激素组和补肾健脾组大鼠胫骨骨髓中Nfatc1蛋白表达的阳性密度显著降低,雌激素组大鼠胫骨骨髓中Nfatc1蛋白表达的阳性密度与假手术组无差异。补肾健脾组大鼠胫骨骨髓中Nfatc1蛋白表达的阳性密度仍明显高于假手术组。假手术组与空白对照组的上述指标均无统计学差异,从而排除手术因素的影响。结论(1)切除大鼠卵巢可使骨BV/TV、Tb.N明显减少而使SMI、Tb.Sp明显增加,并使骨生物力学性能降低,导致骨质疏松症发生:补肾健脾方能在一定程度使以上指标发生逆转而对卵巢切除所致的大鼠骨质疏松症产生治疗作用。(2)切除大鼠卵巢可使骨髓中TRAF6、c-Src、Nfactl蛋白表达显著增加,使破骨细胞异常活跃,导致骨量丢失;而补肾健脾方能通过抑制TRAF6、c-Src、Nfactl的蛋白表达,抑制破骨细胞活性,从而减少骨量丢失。这是其能够治疗骨质疏松症的机理之一。