研究背景：乙型肝炎病毒感染(hepatitis B virus, HBV)是当前全球慢性肝病的最主要原因,也是全世界的健康威胁。全球大约有20亿人曾经感染过HBV,其中3.5亿人是慢性HBV感染。全球每年约有100万人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝癌。2006年全国乙型肝炎流行病学调查结果表明,我国慢性HBV病毒感染者为9300万人,其中慢性乙型肝炎(CHB)患者约2000万例。我国属HBV感染中流行区,每年约有1%的乙型肝炎患者进展为肝衰竭。肝功能衰竭是一种由于各种因素导致肝细胞坏死,出现腹水、黄疸、肝性脑病和凝血功能障碍为主要表现的肝脏疾病,其临床症状复杂,进展迅速,病死率高,预后极差,严重威胁人类健康。我国肝衰竭最常见的类型是慢加急性肝衰竭(actue on chronic liver failure, ACLF),而HBV相关ACLF占总ACLF的80%以上。在慢性肝病患者中,血小板减少(PLT计数<150,000/μl)是一个常见的现象。据报道,在肝硬化患者当中,约占76%。我们在肝衰竭患者中往往能发现更严重的血小板减少。由于血小板减少,易发生出血等并发症,而导致患者住院时间延长、住院费用增加等。引起肝病患者血小板减少的因素是多方面的,如促血小板生成素活性减低,血小板脾脏滞留,慢性HCV感染引起骨髓抑制,抗病毒的干扰素治疗,血小板破坏增多等。本实验研究中,我们描述了HBV相关慢加急肝衰竭患者血小板计数的临床特征,探寻了血小板计数与患者预后的关系,对影响肝衰竭患者血小板计数的多重因素进行分析,以寻找出引起血小板减少的主要原因。研究目的：1.描述HBV相关慢加急肝衰竭患者血小板计数特征及动态变化。2.探讨慢性肝病患者血小板计数与短期死亡率的关系。3.研究HBV相关慢加急性肝功能衰竭患者血小板变化模式与预后的关系。4.对慢性肝病患者血小板减少的相关危险因素指标进行比较。5.对影响血小板计数的指标进行多因素分析,建立数学模型,分析引起血小板减少的主要因素。研究方法：1.纳入在南方医院肝病中心住院(2011年12月到2014年8月)的慢性乙型病毒性肝炎(CHB)、HBV相关肝硬化(LC)、HBV相关慢加急性肝衰竭(ACLF)患者。纳入标准：诊断分别符合慢性乙型肝炎诊疗指南(2010版)、肝衰竭诊治指南(2012版),肝硬化的诊断基于肝脏病理活检或者实验室检查、肝脏影像学及出现门脉高压的症状(如脾大、腹水、食管静脉曲张等表现)。排除标准：1)、入院前或住院期间已诊断为原发性肝细胞癌或接受肝脏移植的病人；2)、合并血液系统恶性疾病,如血液肿瘤、骨髓抑制、或使用具有骨髓抑制的药物者；3)、入院前,有明确出血事件或输血史者；4)、合并有其他类型肝病病史者；5)、6个月内有使用影响血小板计数的药物或毒物；6)、既往接受过脾脏切除术；2.收集患者的基础资料和临床检测指标,腹部B型超声或CT检查脾脏厚度及肝硬化情况。每个患者的临床检测指标,包含血小板计数,生物化学指标(谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、白蛋白等),凝血指标(纤维蛋白原、PT-INR、D-二.聚体)等。检测患者网织血小板比率、促血小板生成素水平、血小板活化比率(PAC-1、CD63、CD62p)、糖萼素、可溶性CD163、凋亡血小板比率等指标,对以上指标进行单因素和多因素线性回归分析,寻找引起血小板减少主要因素。收集了患者入院当日、入院后一周、最后随访三个时间点血小板数值,记录患者28天生存情况。3.对南方医科大学南方医院肝病中心2011年2月至2015年1月诊断并治疗的HBV相关慢加急性肝衰竭患者资料进行回顾性分析,纳入标准：肝衰竭诊治指南(2012版)。收集患者第1天、第7天、第15天、第1月、第2月及最后一次随访时间的血小板计数水平,进行血小板变化模式分组,并通过电话随访了解患者的生存情况,使用Kaplan-Meier方法进行生存分析,不同分组患者生存率采用Log-rank检验进行比较。4.制备血小板取患者静脉血,用枸橼酸钠抗凝管,按照1：9抗凝,125g离心20分钟,得到富血小板血浆(PRP),PRP经850g离心5分钟,得到血小板沉淀,用血小板洗液重悬,得到洗涤血小板。同时采集患者血浆和血清,-20℃冻存。5.流式细胞仪检测网织血小板运用流式细胞仪和荧光RNA染料噻唑橙检测网织血小板,两个流式管中均加入充分混匀的全血5μl和CD61 PerCP1μl,其中一个为实验管(加lml 0.1%噻唑橙),另外一个对照管(加入lml PBS)。常温避光,孵育30分钟后,1200g离心2.5分钟,用1mlPBS重悬,进行流式细胞仪荧光检测。流式细胞仪收集至少10000个血小板。6.活化血小板的流式检测5ul抗凝全血加入到每个流式管中,后加入10μlCD61 PerCP,设置实验管3管和对照管2管,实验管中分别加入CD62P PE 5μl、CD63 PE 5μl、PAC-1 FITC 20μl,对照管中分别加入Mouse 1gG PE 5μl、 RGDS 10μl+PAC-1 FITC 20μl,室温避光孵育30分钟后,加入1mlPBS重悬,1500转,离心5分钟,重复1遍,后废弃上清液。吸取200μl浓度为2%的多聚甲醛加入,2～8℃冰箱保存,在2小时后进行流式检测。7.流式细胞仪检测磷脂酰丝氨酸(PS)暴露取1×108个/100μl洗涤血小板,离心后加入250μl 1 x Annexin-V结合缓冲液和5μl的FITC-Annexin V在避光震荡条件下室温孵育30分钟后,进行流式细胞仪检测。研究结果：1.HBV相关慢加急性肝衰竭患者血小板计数临床特征及短期变化,纳入本研究的HBV相关慢性肝病患者共191例,其中慢乙肝组68例,肝硬化组48例,慢加急性肝功能衰竭组75例。ACLF患者血小板计数[98(3-253)10^9/L]较CHB[172(24-327)10^9/L](P<0.0001)患者低,而与LC患者[88(22-244)10^9/L],(P=0.913)相当。ACLF患者入院后1周血小板计数[71(4-208)10^9/L]较入院当天[97(21-267)10^9/L]明显下降(P<0.0001),慢乙肝、肝硬化组血小板计数一周内无明显变化。2.HBV相关慢性肝病患者入院血小板计数与短期死亡率的关系.ROC曲线结果显示,患者入院血小板计数具有预测28天死亡的能力：AUROC=0.716(0.6332-0.7988),P<0.0001。3.将HBV相关慢加急性肝功能衰竭患者(n=114)按照血小板变化模式分为三组,分别为PLT持续下降组、PLT下降回升组、PLT低水平组。PLT下降回升组的4周生存率100%,显著高于PLT持续下降组47.4%(P<0.0001)和PLT低水平组64.9%(P=0.001)。PLT持续下降组、PLT下降回升组、PLT低水平组,长期生存率为13.2%、95.8%、40.4%。PLT下降回升组的长期生存率亦显著高于其余两组。4.HBV相关慢性肝病患者之间血小板相关指标的比较,网织血小板比率、促血小板生成素水平(TPO)、血小板活化状态(CD62p、CD63)、血小板破坏水平(糖萼素)、凋亡血小板比率,慢加急性肝功能衰竭组与慢乙肝组均无统计学差异。实验室指标,慢加急性肝功能衰竭患者巨噬细胞活化水平sCD163 (ug/mL)较慢乙肝组(53.3 vs.18.1,P<0.0001)高,PAC-1(+)阳性率3.33(0.1-38.4)较慢乙肝10.7(0.3-64.9)(P=0.002)低。临床指标,慢加急性肝功能衰竭组患者脾脏厚度(40.4 vs.35.2mm,p=0.002)、D-二聚体(443.5 vs. 90ug/L,p=0.002)、PT-INR(2.14 vs.1.26, P<0.0001)均高于慢乙肝组。但纤维蛋白原水平(1.24 vs. 2.25g/L,P<0.0001)低于慢乙肝组。5.引起HBV相关慢加急性肝功能衰竭患者血小板减少的危险因素分析。血小板计数与与纤维蛋白原水平(Rs=0.478,P<0.0001)、白蛋白水平(Rs=0.335,P<0.0001)、谷丙转氨酶水平(Rs=0.199,P=0.007)、糖萼素水平(Rs=0.484,P<0.0001)呈正相关,与脾脏厚度(Rs=-0.488,P<0.0001)、PT-INR(Rs=-0.270,P<0.0001)、总胆红素水平(Rs=-0.171,P=0.025)、血小板凋亡水平(Rs=-0.251,P=0.027)呈负相关。多元线性回归分析显示,脾脏厚度、糖萼素水平,纤维蛋白原水平是慢性肝病患者血小板计数的独立危险因素,血小板计数=137.937+21.658纤维蛋白原(g/L)-2.249脾脏厚度(mm)+0.020糖萼素水平(1nmg/ml)(R2=0.597,P=0.011).结论：1.肝衰竭和肝硬化组血小板计数显著低于慢乙肝组,慢加急性肝功能衰竭患者入院一周内血小板下降显著,而慢乙肝、肝硬化患者无此变化。2.患者短期死亡率与入院血小板计数关系密切,患者入院时血小板计数可预测短期预后。3.慢加急性肝衰竭患者,血小板下降回升组的短期及长期生存率均高于持续下降组和低水平组,血小板的变化模式与患者预后有着密切的关系。4.网织血小板比率、TPO水平、CD62(+)比率、CD63(+)比率、糖萼素水平、凋亡血小板比例在慢乙肝组、肝功能衰竭组之间均无统计学差异,提示血小板生成、破坏、凋亡比率在这两组之间差异不大。慢加急性肝衰竭患者脾脏厚度、D-二聚体、PT-INR, sCD163均高于慢乙肝组,而PAC-1(+)比率、纤维蛋白原水平均低于慢乙肝组。巨噬细胞活化、脾脏滞留、凝血消耗在此两组间有差异,可能与血小板减少有关。5.血小板计数与纤维蛋白原水平、白蛋白(ALB)水平、谷丙转氨酶水平(ALT)、糖萼素水平呈正相关,与脾脏厚度、PT-INR、总胆红素(TBIL)水平、血小板凋亡水平呈负相关。在纳入了多种因素进入回归分析后,得出脾脏厚度、纤维蛋白原、糖萼素是慢性肝病血小板减少的独立危险因素。