天南星(Arisaema erubescens (Wall.)、掌叶半夏(Pinellia pedatisecta Schott.) Schott.)和白附子(Typhonium giganteum Engl.)均为天南星科有毒中药。三种有毒中药刺激性毒性极为相似,均表现为麻舌而刺喉,具有“戟人咽”的刺激性。误服均出现口唇及咽喉肿痛、呼吸困难等症状,严重情况下出现死亡。正是由于此种毒性,中医临床上以使用其炮制品为主。论文作者所在课题组前期已经确定天南星、掌叶半夏和白附子中的针晶是三种有毒中药的主要刺激性毒性物质,因其晶型特异,可产生严重的刺激性炎症反应,故被课题组称为“毒针晶”。毒针晶可引起家兔眼结膜强烈水肿、小鼠腹腔毛细血管通透性增强、大鼠足跖肿胀等炎症反应的发生；前期研究结果显示毒针晶呈现针状,两头尖利,表面具有明显的倒刺和凹槽,这种特异的晶体结构使其可刺入机体组织,从而引起一系列的炎症反应,但其作用机制尚不明确。前期研究发现毒针晶主要由草酸钙和蛋白组成,对组成针晶的草酸钙进行研究发现其不具有刺激性作用,而毒针晶中的蛋白成分却能引起家兔眼结膜强烈水肿。课题组前期对毒针晶中蛋白进行研究,发现针晶中含有能进一步诱发炎症反应的毒性蛋白——“凝集素蛋白”,且发现天南星、掌叶半夏和白附子的毒针晶中含有的凝集素蛋白即为其生品中的凝集素蛋白。将三种有毒中药凝集素蛋白提取分离并注射至大鼠腹腔,发现大量中性粒细胞向大鼠腹腔部位迁移聚集,而中性粒细胞向炎症部位迁移是炎症产生的重要标志,因此认为天南星、掌叶半夏和白附子中的凝集素蛋白均可诱导炎症发生,但其为什么可诱导炎症的发生?此作用机制尚需要进行进一步研究确定。本课题组前期对天南星科有毒中药天南星、掌叶半夏和白附子的凝集素蛋白的炎症刺激性在细胞水平进行初步研究,发现这三种凝集素蛋白诱导中性粒细胞迁移的数量随着体内居留巨噬细胞数量的上升而增加,课题组前期曾更深入的对天南星科另一种有毒中药半夏中的毒针晶及凝集素蛋白进行研究发现,半夏的毒针晶及凝集素蛋白均能使巨噬细胞发生活化,诱导巨噬细胞释放炎症因子,激活巨噬细胞内重要炎症信号通路NF-κB (Nuclear factor-kappa B),从而诱导炎症发生。天南星、掌叶半夏和白附子,与半夏同属天南星科,毒性物质基础及引起的炎症反应均与半夏相似,那么,天南星、掌叶半夏和白附子的毒针晶及凝集素蛋白是否也具有致炎作用,而巨噬细胞在其致炎作用中起到了怎样的作用?故本论文对半夏以外其他三种有毒中药天南星、掌叶半夏和白附子毒针晶及凝集素蛋白的致炎作用进行研究,提出天南星科有毒中药天南星、掌叶半夏和白附子的致炎作用与巨噬细胞密切相关的假说,深入揭示天南星科有毒中药天南星、掌叶半夏和白附子的致炎作用的机制。主要工作内容和研究结果包括以下几方面：1.天南星、掌叶半夏和白附子毒针晶的致炎作用采用SEM (Scanning Electron Microscope,扫描电子显微镜)观察经天南星、掌叶半夏和白附子三种毒针晶刺激后巨噬细胞的形态变化,结果显示巨噬细胞可吞噬天南星、掌叶半夏和白附子三种毒针晶,当毒针晶浓度为6.25μg/mL至12.5μg/mL时,巨噬细胞活化,体积增大,并产生伪足,但细胞膜未被破坏；而当毒针晶浓度达到25μg/mL时,巨噬细胞吞噬作用明显增强,刺激达2h后,细胞膜发生破裂。此实验结果表明巨噬细胞确实参与到天南星、掌叶半夏和白附子三种毒针晶的致炎作用中。采用大鼠腹腔巨噬细胞体外培养模型,以TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α)和IL-1β (Interleukin-1β)为指标,研究天南星、掌叶半夏和白附子三种毒针晶刺激巨噬细胞使其释放炎症因子的影响,结果显示,与空白组相比,不同浓度的三种毒针晶刺激巨噬细胞1h后,均可引起TNF-α和IL-1β的含量显著增加,此结果呈剂量依赖性；刺激1-6h,上升速度较快,刺激6-12h达到最大值并保持稳定。此实验结果表明天南星、掌叶半夏和白附子三种毒针晶可刺激巨噬细胞释放炎症因子,引起机体的炎症反应,在扫描电镜实验基础上,进一步表明三种毒针晶的致炎作用与巨噬细胞相关。采用巨噬细胞-中性粒细胞体外共培养迁移模型,研究天南星、掌叶半夏和白附子三种毒针晶刺激巨噬细胞对中性粒细胞迁移的影响,结果显示不同浓度的三种毒针晶刺激巨噬细胞1h后,与PBS (phosphate buffered saline)+MO (macrophage)组比较,中性粒细胞迁移数量增加；而单纯的巨噬细胞和单纯的毒针晶本身均不能诱导中性粒细胞迁移。此实验结果表明,天南星、掌叶半夏和白附子三种毒针晶刺激巨噬细胞能显著诱导中性粒细胞迁移聚集,表明巨噬细胞在此过程中发挥重要作用。中性粒细胞向炎症部位迁移是炎症反应发生的重要环节,因此,进一步证实三种毒针晶的致炎作用与巨噬细胞密切相关。上述研究表明天南星、掌叶半夏和白附子三种毒针晶是通过刺激巨噬细胞使其活化,并激活巨噬细胞释放大量炎症因子,同时诱导中性粒细胞向炎症部位迁移,从而产生一系列的炎症反应。实验结果确证了三种毒针晶确实能够诱导炎症毒性,且其致炎作用与巨噬细胞密切相关。2.天南星、掌叶半夏和白附子凝集素蛋白的致炎作用采用SEM观察经天南星、掌叶半夏和白附子块茎中提取分离出的三种凝集素蛋白AEL、PPL和TGL刺激后巨噬细胞的形态变化,结果显示天南星、掌叶半夏和白附子三种凝集素蛋白均可活化巨噬细胞,当凝集素蛋白浓度为6.25μg/mL至12.5μg/mL时,巨噬细胞活化,体积增大,并产生伪足,但细胞膜未被破坏：而当凝集素蛋白浓度达到25μg/mL时,并刺激巨噬细胞达2h后,细胞膜发生破裂。该实验结果与三种有毒中药的毒针晶刺激巨噬细胞产生的炎症一致,说明凝集素蛋白诱导炎症发生与巨噬细胞相关,也说明毒针晶诱发的巨噬细胞活化与毒针晶带有的凝集素蛋白有关。采用大鼠腹腔巨噬细胞体外培养模型,以TNF-α和IL-1p为指标,研究天南星、掌叶半夏和白附子三种凝集素蛋白刺激巨噬细胞使其释放炎症因子的影响,结果显示,与空白组相比,不同浓度的三种凝集素蛋白刺激巨噬细胞1h后,均可引起TNF-α和IL-1p的含量显著增加,此结果呈剂量依赖性；刺激1-6h,上升速度较快,刺激6-12h达到最大值并保持稳定。此实验结果表明天南星、掌叶半夏和白附子三种凝集素蛋白能通过刺激巨噬细胞释放炎症因子从而引起机体的炎症反应,在扫描电镜实验基础上,进一步表明三种凝集素蛋白的致炎机制与巨噬细胞相关。采用巨噬细胞-中性粒细胞体外共培养迁移模型,研究天南星、掌叶半夏和白附子三种凝集素蛋白刺激巨噬细胞对中性粒细胞迁移的影响,结果显示不同浓度的三种凝集素蛋白刺激巨噬细胞1h后,与PBS+Mφ组比较,中性粒细胞迁移数量增加,而单纯的巨噬细胞和单纯的凝集素蛋白本身均不能诱导中性粒细胞迁移。此实验结果表明,天南星、掌叶半夏和白附子三种凝集素蛋白刺激巨噬细胞能显著诱导中性粒细胞迁移聚集,表明巨噬细胞在此过程中发挥重要作用。中性粒细胞向炎症部位迁移是炎症反应发生的重要环节,因此,进一步证实三种凝集素蛋白的致炎作用与巨噬细胞密切相关。上述研究表明天南星、掌叶半夏和白附子三种凝集素蛋白是通过刺激巨噬细胞使其活化,并激活巨噬细胞释放大量炎症因子,同时诱导中性粒细胞向炎症部位迁移,从而产生一系列的炎症反应。实验结果表明三种有毒中药能诱发炎症反应与其带有的凝集素蛋白刺激巨噬细胞活化有关,三种有毒中药的毒针晶被巨噬细胞吞噬,但诱发的炎症反应与针晶带有的凝集素蛋白相关。3.天南星、掌叶半夏和白附子凝集素蛋白的致炎机制研究对天南星科有毒中药天南星、掌叶半夏和白附子的毒性作用机制在细胞及分子水平进一步研究,采用Western Blot法,以巨噬细胞内炎症信号通路NF-κB中单体P65的转核及其抑制剂IκB (I-kappa B)为指标,观察天南星、掌叶半夏和白附子三种凝集素蛋白刺激巨噬细胞前后P65分别在细胞浆及细胞核中的表达水平以及IκB在细胞浆中的表达水平,并检测NF-κB信号通路阻断剂BAY11-7082对P65入核的影响。结果显示不同浓度的三种凝集素蛋白刺激巨噬细胞1h后,与空白组相比,巨噬细胞胞浆内的P65含量显著下降,而巨噬细胞胞核内的P65含量显著上升,并呈剂量依赖性,且NF-κB抑制剂IκB在细胞浆中表达升高,呈剂量依赖性。此实验结果表明,天南星、掌叶半夏和白附子三种凝集素蛋白刺激巨噬细胞诱发炎症与巨噬细胞内的信号通路相关,凝集素蛋白能够激活巨噬细胞内NF-κB炎症信号通路,促使抑制剂从NF-κB上脱落,使巨噬细胞胞浆中的P65从细胞浆向细胞核内转移,实验证实了三种凝集素蛋白刺激巨噬细胞诱导炎症产生的机制与NF-κB炎症信号通路相关。将巨噬细胞在不同浓度的NF-κB信号通路阻断剂BAY11-7082条件下进行孵育后,再用三种凝集素蛋白刺激1h,结果显示,与凝集素组相比,BAY11-7082浓度越大,巨噬细胞细胞核内的P65含量越低,而巨噬细胞胞浆内的P65含量越高,此结果呈剂量依赖性。此实验结果表明,BAY11-7082能抑制巨噬细胞胞浆中的P65入核,阻断三种凝集素蛋白对巨噬细胞内NF-κB的激活作用,进一步证实三种凝集素蛋白刺激巨噬细胞诱导炎症产生的机制与激活NF-κB炎症信号通路密切相关。4.天南星、掌叶半夏和白附子凝集素蛋白对巨噬细胞死亡模式的影响上述实验已证实巨噬细胞与天南星科有毒中药天南星、掌叶半夏和白附子的毒性作用机制密切相关,那么巨噬细胞被刺激后呈现何种死亡模式而引起炎症反应有待研究,可进一步深入阐释天南星科有毒中药的刺激性毒性机制。采用流式细胞术,检测巨噬细胞经天南星、掌叶半夏和白附子三种凝集素蛋白刺激后的死亡模式。结果显示,50μg/mL的凝集素蛋白刺激巨噬细胞1-6h,与空白组相比,1h时巨噬细胞发生早期凋亡,而未发生坏死；2～6h时,巨噬细胞发生早期凋亡的同时开始出现坏死,并随着时间的延长坏死细胞逐渐增多。证实了三种凝集素蛋白能诱发巨噬细胞发生坏死从而导致机体炎症产生。采用透射电镜法,观察巨噬细胞经天南星、掌叶半夏和白附子三种凝集素蛋白刺激后的内部形态结构变化来判断其死亡模式。结果显示,50μg/mL的凝集素蛋白刺激巨噬细胞1～6h,与空白组相比,1h时巨噬细胞胞核内染色质边集,显示巨噬细胞发生早期凋亡,而未发现坏死细胞：2h时,巨噬细胞发生早期凋亡的同时少数细胞胞膜破裂,细胞核裸露,显示出现坏死细胞,4h时坏死细胞逐渐增多,6h时坏死细胞达到最大值。此实验与上述流式细胞术结果一致,进一步证实了三种凝集素蛋白能诱发巨噬细胞发生坏死从而导致机体炎症产生。研究进一步采用流式细胞术,在动物体内检测腹腔内巨噬细胞经天南星、掌叶半夏和白附子三种凝集素蛋白刺激后的死亡模式。结果显示50μg/mL的AEL、 PPL和TGL腹腔注射,与空白组相比,巨噬细胞发生早期凋亡,并伴随坏死细胞的产生,并随着时间的延长坏死细胞逐渐增多。结果表明,AEL、PPL和TGL在体内环境中也能刺激巨噬细胞使其发生坏死。与体外实验结果一致,证实凝集素蛋白可刺激动物体内巨噬细胞发生坏死,说明天南星科有毒中药引起强烈的刺激性毒性作用与其中含有的凝集素蛋白刺激机体内巨噬细胞活化、早期凋亡至坏死而产生炎症反应有关。通过上述研究表明,天南星科有毒中药天南星、掌叶半夏和白附子中的毒针晶及凝集素蛋白能活化巨噬细胞,刺激巨噬细胞使其释放大量炎症因子,并诱导中性粒细胞向炎症部位迁移聚集,产生一系列的炎症反应。这种炎症反应的机制是激发NF-κB信号通路促使P65从胞浆转入胞核内,并促使巨噬细胞从早期凋亡到坏死,从而导致炎症因子释放,最终诱导炎症产生。本论文的研究结果对深入研究天南星科有毒中药的致炎机制提供研究基础及方法借鉴,并将为天南星科有毒中药炮制方法的改进与创新提供理论支持。