目的三丁基锡(Tributyltin,TBT)是一种典型的环境肥胖因子,可以在纳摩尔浓度下诱导过氧化物酶体增殖物活化受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)的表达,进而诱导脂肪增生和肥胖进展。TBT曾被广泛地应用于农业和工业生产,同时具有亲脂性强、半减期长的特点,因此广泛地分布于环境介质中。人体可通过饮水、海产品摄入、食品包装等途径接触此物质。我们课题组先前的研究表明,青春期较低浓度TBT暴露可以在小鼠体内引起代谢综合征,即体重增长、血脂异常、糖耐量异常、非酒精性脂肪肝以及胰岛素信号通路损伤。先前的研究指出TBT诱发肥胖及代谢性异常的发生发展与胰岛细胞的凋亡、脂联素水平紊乱、表观遗传改变、炎症等因素有关,但TBT引起肥胖、代谢紊乱的机制较为复杂尚需在更多方面进一步探讨。人类肠道中存在着大量的微生物,它们含有大约1014个细胞,基因数量更是高达人类基因组的100多倍。肠道微生物群通过参与食物的消化、吸收、代谢等生理过程,在代谢稳态中发挥重要的作用。近年来,肠道菌群失调在肥胖进展中的作用正受到越来越多的重视。同时,已有研究者开始关注环境中的化学物质暴露通过影响肠道微生物的稳态影响机体的代谢功能继而造成肥胖的发生发展的现象。虽然越来越多的研究显示TBT暴露可导致实验动物肥胖、代谢紊乱,但尚未有研究探讨TBT是否导致动物肠道菌群组紊乱以及菌群结构改变是否与受试动物肥胖发生存在关联。因此,本课题第一部分将从以下几个角度来探析TBT暴露、肠道菌群紊乱及肥胖进展的关系:1)从表型上验证暴露于环境水平的TBT后引起代谢综合征;2)通过宏基因测序技术检测,检验TBT暴露是否可以诱发小鼠肠道菌群的改变;3)探讨TBT暴露诱发的菌群紊乱与小鼠肥胖之间的关联关系。阐明了 TBT扰乱受试动物肠道菌群组成与肥胖发生的关联后,我们进一步探讨低剂量TBT暴露对骨健康的影响。PPARγ是脂肪细胞分化形成过程中的关键性因子,PPARγ的高表达可以促进脂肪细胞的分化过程。骨髓腔内间充质干细胞是骨细胞和脂肪细胞的祖细胞,且二者的定向分化具有非此即彼的排他性特点。骨髓腔内脂肪细胞的高分化与多种骨代谢疾病相关。先前体外、体内研究都显示,TBT可诱导骨髓间充质干细胞在牺牲成骨向分化的基础上,向脂肪方向分化,提示TBT暴露可能会影响骨骼健康,但目前尚无系统的研究。双能X-线骨密度测量仪法(DXA)是WHO公认的无创检测骨密度和诊断骨质疏松症的“金标准”。我们在应用DXA法检测小鼠股骨骨密度时,发现小鼠股骨骨密度低于我们所采用的骨密度仪(NORLAND XR-600)的仪器检测限,故我们使用SD大鼠进行骨健康相关的实验。本课题第二部分将从以下几个角度来探析TBT对骨健康影响的表型分析,并探讨其可能的分子基础:1)应用DXA法和三点弯曲实验评估TBT暴露对大鼠股骨的骨密度和力学性能的影响;2)通过HE染色和油红O染色进一步观察TBT暴露对股骨的形态学特点;3)采用定量PCR扩增技术检测TBT对骨形成标志物以及脂肪形成标志物基因表达的影响;4)通过免疫组化、免疫荧光的方法探究TBT暴露对成脂成骨标志物及其可能的调控网络的影响。方法1.TBT暴露致小鼠肥胖模型建立及鉴定21日龄雄性无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级ICR小鼠适应性喂养3天后根据体重随机分成为2组,每组10只。小鼠每3天进行一次腹腔注射,共计暴露10次。注射物为溶于玉米油的TBTC1,其染毒剂量为0,50μg/kg(按照5 ml/kg·bw注射)。每次腹腔注射前称量并记录体重,根据当天的体重调整注射量。最后一次TBTCl染毒后,对小鼠再进行30天的正常饲养。实验终点时,各组中随机选取4只小鼠,在无菌环境下挤压小鼠腹部收集其排出的粪便,储存于-80℃。实验结束时,称量各小鼠体重,轻微麻醉后从小鼠眼眶后静脉丛采血,室温下静置2h后,3000g*15分钟分离血清并储存于-80℃以检测血清中甘油三酷(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL);小鼠取血后颈椎脱臼法处理,解剖、分离附睾脂肪组织和肾周脂肪组织,天平称重。2.16s rRNA测序及分析提取小鼠粪便中的总DNA后,进行PCR扩增及产物纯化,经过质检后的文库混合后,加入到Illumina MiSeq测序平台进行高通量并行测序。对数据进行过滤后,对菌群的Alpha多样性、Beta多样性进行分析并进行差异检验。3.TBT引起的肠道菌群紊乱与代谢异常的关联性分析通过分析小鼠体重增长与香农指数、辛普森指数、变形菌门丰度以及乳酸杆菌科丰度之间的线性相关性,建立TBT暴露、肠道菌群紊乱及体重增长的关联。4.TBT暴露致大鼠骨密度下降模型建立21天龄雄性SPF级SD大鼠适应性喂养3天后根据体重分为4组,每组10只。大鼠每3天进行一次灌胃染毒,共60天。注射物为溶于玉米油的TBTC1,其染毒剂量为0、0.5、5、50μg/kg(按照5ml/kg·bw注射)。每次灌胃前称量并记录体重,根据当天的体重调整注射量。最后一次TBTC1染毒后,实验动物再饲养10天(PNDs94)处死。5.大鼠股骨骨密度及生物力学性能评价处死大鼠后,取右侧股骨,小心去除肌肉、结缔组织,测量其重量和长度。双能X-线吸收仪(Dual-energy X-ray absorptiometry,DXA)法测量股骨干骺端和骨干端骨密度,随后进行三点弯曲实验,通过位移—应力曲线分析得出骨的最大负荷和刚度系数。6.大鼠股骨形态学检测取5只大鼠的左侧股骨,去除多余的肌肉组织后,于4%多聚甲醛中固定4天,随后将骨置于10%EDTA溶液中进行脱钙处理。30天脱钙过程完成后,制作股骨的石蜡切片和冰冻切片。石蜡切片进行HE染色,冰冻切片进行油红O染色。观察股骨的形态结构以及脂质累积。7.免疫组化、免疫荧光检测免疫组化方法检测大鼠股骨中脂肪形成标志物(PPARγ)、骨形成标志物转录因子 Runx家族成员2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、Wnt信号通路关键分子糖原合酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3,GSK3β)的表达,免疫荧光方法检测大鼠股骨中Wnt信号通路关键分子(β-catenin)的表达,探讨TBT暴露对骨髓中成脂成骨活性的影响及其可能的调控网路。8.定量RT-PCR分析使用Trizol提取骨髓总RNA,并使用定量RT-PCR分析骨生成主要标志物(Runx2、alkaline phosphatase、osteocalcin)和各种脂肪形成标志物(PPARγ等)的表达情况。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参,检查各靶基因融解曲线并分析各目的基因的相对表达情况。研究TBT暴露对骨髓中脂肪生成和骨生成主要调节转录因子表达的影响。结果1.TBT暴露增加小鼠体重和附睾脂肪组织的质量实验期间,各组小鼠未出现活动及精神异常。体重监测结果显示,实验结束时,相较于对照组,50μg/kg TBTCl组小鼠体重增加了 7.7%(P<0.01)。同时,该组小鼠的附睾脂肪组织质量也显著增加(P<0.01)。2.TBT暴露在小鼠体内诱发肠道菌群紊乱相较于对照组,50μg/kg TBTCl暴露组小鼠观察到的细菌类别数目减少,辛普森指数升高,香农指数降低,菌群物种多样性下降。同时,各菌群所占比例出现明显改变:在门水平上,厚壁菌门比例下降而变形菌门比例显著升高;在科一级中,乳杆菌科和双歧杆菌科所占比例明显下降,螺杆菌科比例升高。3.TBT引起的肠道菌群紊乱与代谢异常存在线性关系通过建立小鼠体重增长与香农指数、辛普森指数、变形菌门丰度以及双歧杆菌科丰度之间的线性关系,我们发现体重增长与香农指数和乳酸杆菌科丰度呈负相关,与辛普森指数、变形菌门丰度呈明显正相关。4.TBT暴露诱发大鼠骨密度下降TBT暴露对骨长、骨重、干骺端骨密度没有造成明显的影响,而50μg/kg TBTCl暴露组中股骨骨干端骨密度明显下降(-18.75%,P<0.01)。生物力学结果显示,虽然各组股骨最大负荷和刚度系数没有统计学差异,但出现了下降的趋势,并满足剂量一反应关系。5.TBT暴露诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂活性增强、成骨活性减弱股骨HE染色中,尽管脂肪细胞粒径在各组间没有出现统计学差异,但我们发现随着染毒剂量升高,脂肪空洞的数量随之显著升高。油红O染色中发现对照组仅有散在的小范围区域出现脂质累积,而TBTCl暴露的各组均出现了大量的脂肪累积,油红O着色区域面积差异显著(较对照组分别升高了2.94,3.45,4.62倍)。同时,血清碱性磷酸酶活性降低,提示骨生成活性减弱。PCR结果进一步发现骨髓中成骨标志物Runx2、碱性磷酸酶表达量下降。最后,免疫组化结果证实,骨髓中成脂标志物PPARγ表达升高,相反,成骨标志物Runx2表达量降低。6.TBT暴露通过抑制Wnt信号通路引起骨髓干细胞分化方向异常免疫组化、免疫荧光结果显示,骨髓中Wnt信号通路的关键分子在不同组中有不同的表达水平:50μg/kg TBTCl暴露组中β-catenin在骨干端和干骺端表达量均出现了明显的下降,提示TBT暴露可以负向调控骨髓中Wnt信号通路的表达。结论1.青春期暴露于环境水平的TBT会诱发小鼠肠道菌群紊乱,且菌群紊乱与肥胖进展密切相关。2.环境水平TBT的暴露使大鼠股骨骨密度下降、骨髓中脂质异常累积。3.TBT暴露可能通过调控Wnt信号通路造成骨髓间充质干细胞成脂分化增强。