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[背景]肿瘤的生长、侵袭和转移受诸多因素影响和制约,血管形成是其重要因素之一。肿瘤血管不仅提供了肿瘤生长所需的营养,而且也是癌细胞播散的途径。在血管内皮细胞的增殖和血管生成过程中,血管内皮生长因子受体2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)起重要作用。目前以肿瘤血管形成为靶点的抗肿瘤治疗研究正成为当前的热点。Fab抗体(fragment antigen binding, Fab)是由两条肽链,即轻链(LC)和重链Fd段(Fd)通过二硫键和非共价键结合在一起,相当于全长IgG1抗体的1/3,其无Fc段,免疫原性低、分子量小,更易到达病灶,半衰期长于单链可变区片断(scFv),广泛用于与生物毒素等的融合表达,目前,成熟的噬菌体展示技术可以制备的完全人源化抗体Fab片断,其免疫排斥反应小,是极具潜力的免疫靶向治疗药物。但是,Fab在原核系统表达量普遍较低。本课题通过噬菌体展示技术成功建立全人源抗VEGFR2 Fab抗体,筛选获得较高亲和力的克隆,根据该Fab片断的特点,设计一段长约110bp的人工合成的linker基因,连接LC和Fd,使二者在一个起始子下翻译和表达,表达产物为一条肽链,形成单链Fab片断(single chain Fab fragment, scFab),借助高效表达载体pET系列,构建分泌型表达重组载体pET25b(+)-scFab和插入HRV3C蛋白酶切位点的融合型表达重组载体pET32a-HRV3C-scFab,通过建立最适表达和纯化条件,提高抗体在大肠杆菌里的可溶表达产量。[方法](1)从人外周淋巴细胞提取总RNA,逆转录为cDNA,通过PCR技术将LC和Fd基因克隆到噬菌体载体pComb3XSS上,构建抗人VEGFR2噬菌体抗体库,通过ELISA筛选亲和力和特异性高的克隆(抗体基因片段)。(2)利用PCR技术,从噬菌体抗体库中高亲和力的克隆中获得LC和Fd基因,在其两端引入酶切位点,以酶切-连接的方式克隆至设计含有linker基因质粒上linker的前后两端,以构建pGH-scFab重组载体方式将LC和Fd基因连接形成scFab基因片段。(3)选择pGH-scFab重组载体上合适的酶切位点,以酶切-连接的方式将scFab克隆至pET25b(+)载体上,构建pET25b(+)-scFab重组载体,转化3种不同的表达型宿主菌BL21(DE3)、Origami2(DE3)和Rosetta-gami 2(DE3),检测蛋白的表达形式,通过在不同温度、不同诱导起始OD600值、不同诱导剂IPTG浓度的条件下,研究pET25b(+)-scFab的最佳表达条件。(4)选择scFab两端合适的酶切位,以酶切-连接的方式克隆至设计含有HRV3C蛋白酶切位点的质粒上HRV3C基因下游,再以以酶切-连接的方式将HRV3C-scFab基因片段克隆至含硫氧还蛋白(Trx)的融合表达载体pET32a上,构建pET32a-HRV3C-scFab重组载体,转化表达型宿主菌Rosetta gami 2(DE3),通过在不同温度、不同诱导起始OD600值、不同诱导剂IPTG浓度的条件下,研究pET32a-HRV3C-scFab的最佳表达条件。(5)在最佳表达条件下,大量表达scFab抗体蛋白,按照镍柱亲和层析纯化,HRV3C蛋白酶切,凝胶层析的先后顺序纯化scFab,用超滤离心浓缩和BCA蛋白定量调整scFab蛋白浓度,再通过ELISA以及流式细胞术检测scFab的亲和力和特异性。[结果](1)构建了人源抗VEGFR2 Fab噬菌体抗体库,并通过4轮筛选获得了亲和力高的克隆pComb3XSS-Fab(33#)。(2)构建了pGH-scFab重组载体,成功地将LC和Fd基因在质粒上连接形成scFab基因片段。(3)构建了pET25b(+)-scFab分泌型表达重组载体,研究显示：最佳表达型宿主菌为Rosetta gami 2(DE3),主要为包涵体表达,最佳诱导温度为20℃,最佳诱导起始OD600值为0.4,最适诱导剂IPTG浓度为0.5mM。(4)构建了pET32a-HRV3C-scFab融合型表达重组载体,用表达型宿主菌为Rosetta gami 2(DE3)进行表达时,主要为可溶表达,最佳诱导温度为20℃,最佳诱导起始OD600值为0.8,最适诱导剂IPTG浓度为0.5mM。(5)先后通过镍柱的亲和层析纯化,HRV3C蛋白酶切,分子筛过滤纯化,超滤离心浓缩,最后得到高纯度的scFab抗体蛋白。蛋白浓度为0.1mg/m1时,直接法ELISA的OD450/570nm值为1.583,竞争抑制ELISA显示其对VEGF有53%抑制率,流式细胞术检测显示对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)有39.62%的结合力。[结论](1)噬菌体抗体库技术是获得人源抗体的有效途径,并且通过反复筛选可以得到高亲和力的克隆。(2)与Overlap PCR技术相比,在质粒上进行两个基因片段连接操作可行性更高,尤其是在像本实验中不易设计引物的情况下。(3)pET25b(+)-scFab和pET32a-HRV3C-scFab重组表达载体的表达条件研究显示：使用含大肠杆菌稀有密码子的宿主菌能显著增加scFab的表达；在没有分子伴侣的条件下,scFab主要以包涵体形式表达,硫氧还蛋白(Trx)的融合scFab进行表达能显著增加scFab的可溶表达量；此外低温、合适的诱导剂IPTG和起始起始OD600值都有利于增加scFab表达量。(4)本实验通过合适的纯化方式组合,最后得到高纯度的scFab抗体蛋白,HRV3C蛋白酶切是在低温(4℃)下进行,这既去除了分子伴侣,又保证了目的蛋白的活性。(5) scFab抗体蛋白的功能检测结果显示：linker的设计,对Fab的空间结构尤其是功能改变不大,但是能显著提高Fab抗体的产量。(6)本实验的研究结果为肿瘤血管靶向治疗动物实验及临床试验奠定基础,为Fab抗体的生产提供一个新的思路,也为本实验室建立了一个高效的原核融合表达平台。