【摘 要】
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果胶酶是指能水解果胶类物质的多种酶的总称。其在全球食品和饮料市场占比为25%,是我国四大酶制剂之一,在食品、纺织、医药、造纸、环境和饲料领域都有广泛应用。但是果胶酶制剂专一性不高,高效、专一的果胶酶制剂在市场上仍然匮乏。为了满足市场对果胶酶的需求,提高果胶酶应用的专一性问题,果胶酶的复配成为了研究的重点。本研究以Aspergillus niger CBS513.88黑曲霉基因组注释的果胶酶基因为基
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果胶酶是指能水解果胶类物质的多种酶的总称。其在全球食品和饮料市场占比为25%,是我国四大酶制剂之一,在食品、纺织、医药、造纸、环境和饲料领域都有广泛应用。但是果胶酶制剂专一性不高,高效、专一的果胶酶制剂在市场上仍然匮乏。为了满足市场对果胶酶的需求,提高果胶酶应用的专一性问题,果胶酶的复配成为了研究的重点。本研究以Aspergillus niger CBS513.88黑曲霉基因组注释的果胶酶基因为基础,构建黑曲霉来源果胶酶基因的毕赤酵母异源表达载体,将果胶酶基因整合到酵母X33宿主菌株基因组上,在甲醇诱导下进行果胶酶基因的表达和纯化,进一步进行了果胶酶的应用研究。主要研究结果如下:（1）根据基因组注释的20个果胶酶基因序列（包括11个聚半乳糖醛酸酶、6个果胶裂解酶、3个果胶酯酶）,成功克隆出14个果胶酶基因,构建果胶酶酵母表达菌株,经过果胶酶酶活测定、SDS-PAGE电泳分析,检测到11个果胶酶基因在酵母X33胞外分泌表达。将表达成功的果胶酶基因进行酶学性质的测定。（2）通过酶学性质鉴定结果表明:聚半乳糖醛酸酶的蛋白大小在35-56 k Da之间,最适温度在45-60℃,大多数为最适温度在50℃,最适p H在4-6之间,聚半乳糖醛酸酶具有良好的稳定性。除聚半乳糖醛酸酶4986099和4979782外,Fe3+、Ba2+、Ca2+可以提高聚半乳糖醛酸酶的酶活;果胶裂解酶的蛋白大小为38-45 k Da,果胶裂解酶4990338的最适温度为35℃、4987294最适温度为55℃,最适pH分别为9和7,表明果胶裂解酶p H为中性偏碱性,Ca2+、Mn2+可以提高果胶裂解酶的酶活;果胶酯酶蛋白大小在40-60 k Da之间,果胶酯酶最适温度在40-50℃,最适p H 5-7,1 mmol/L浓度的Ca2+、Fe3+、Mn2+可以提高果胶酯酶活性。（3）最适底物选择:果胶酶分别裂解不同水果皮来源的果胶,通过动力学分析得出果胶酶对底物的亲和程度,聚半乳糖醛酸酶对聚半乳糖醛酸具有最大亲和性,果胶裂解酶亲和性较好的为香蕉来源果胶,果胶酯酶亲和性高的果胶有橘子果胶和香蕉果胶。（4）复配:按照同种类型果胶酶复配和不同类型果胶酶复配为基础进行酶的复配,共复配了10种复合酶。研究发现复合酶裂解效果比单一酶裂解效果好,复合酶4对四种底物裂解效果都比较优秀,通过产物和底物峰面积比得到裂解率达到98%以上。复合酶4对橙子来源果胶裂解率达到95%以上,复合酶1、复合酶4对柑橘来源果胶裂解率达到95%以上。复合酶3、复合酶4、复合酶5对香蕉底物裂解率达到97%以上。
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