论文部分内容阅读
基因沉默,又称为RNA干扰,是真核细胞调控基因表达的一种重要的分子机制。在真核细胞中,小分子RNA引导AGO蛋白至m RNA形成RNA诱导沉默复合体,小分子RNA通过碱基互补配对的方式与靶RNA结合,利用AGO蛋白水解酶的性质,通过切割降解靶RNA或抑制靶RNA翻译的方式调控靶RNA的表达。在哺乳动物细胞中,AGO2是唯一一个具有切割活性的AGO蛋白家族成员,在哺乳动物基因表达的调控过程中发挥着重要的功能。经典的基因沉默过程的发生场所为细胞质基质,而近些年的研究表明,AGO2作为沉默复合体的核心成员同样存在于细胞核。已知细胞核中的AGO2参与DNA损伤修复,调控DNA甲基化进程以及RNA的可变剪接,但其参与上述细胞进程的具体分子机制并未被详尽阐述。本研究利用细胞核蛋白进行免疫共沉淀（Co-IP）的实验找出细胞核中AGO2的相互作用蛋白,进行质谱分析及GO（Gene Ontology）分析,结果显示与AGO2相互作用的核蛋白中,有一组可变剪接相关蛋白,hnRNP U便是其中之一。RNA的可变剪接是真核生物的一种重要的调控基因表达的分子机制。同一基因的pre-m RNA通过剪接体的不同加工方式可以产生不同的转录本,从而产生不同功能的蛋白,是后生生物蛋白多样性的主要原因。hnRNP蛋白家族是参与剪接调控的重要蛋白家族,他们参与可变剪接的过程是复杂且灵活的,其中hnRNP U是该蛋白家族中分子量最大的蛋白,通过调控剪接体组成成员U2 sn RNP的成熟调控剪接,在可变剪接的调控中起到了重要的作用。本研究通过利用核蛋白进行Co-IP实验证实了AGO2与hnRNP U存在相互作用,并利用细胞免疫荧光实验证明了二者在细胞核中存在共定位。构建了原核表达载体GST-AGO2与His-hnRNP U,利用GST-Pulldown实验检测到二者并非直接结合,说明该相互作用是某些中间因子介导的间接的相互作用。之后,利用RNase A降解RNA的方法证明了AGO2与hnRNP U的相互作用依赖于RNA。利用失去小分子RNA结合能力的AGO2的突变体——AGO2-Y529E,证明AGO2通过小分子RNA的介导与hnRNP U结合在共同的RNA上形成功能性的复合物。本研究利用过表达以及干扰表达量的方法,证明在这一复合物中,AGO2与hnRNP U会促进对方蛋白水平的下调,且证明两者蛋白水平下调是通过蛋白酶体途径促进的蛋白降解。转染hnRNP U后,分别利用细胞核与细胞质基质蛋白提取物检测蛋白量,研究发现hnRNP U会同时下调细胞核与细胞质基质中AGO2的表达量。考虑到hnRNP U只存在于细胞核中,且促进细胞核内AGO2的降解,所以找出并预测了4个核内靶RNA,并通过q-PCR检测核内靶标的RNA水平验证了hnRNP U通过影响AGO2的表达量调控细胞核内的RNA干扰。本研究验证了2个hnRNP U参与调控可变剪接的新的靶基因——ZFY与GADD45A,同之前文献报道的靶基因共同证明了AGO2通过影响hnRNP U的表达量调控可变剪接。进一步的实验表明,AGO2调控可变剪接的能力与其小分子RNA的结合能力密切相关,小分子RNA不仅通过介导AGO2与hnRNP U的相互作用使AGO2与hnRNP U形成复合物,通过hnRNP U依赖的方式影响剪接,而且通过介导AGO2与靶RNA结合以hnRNP U不依赖的方式间接调控剪接。实验结果还表明,AGO2的核质分布也会影响其参与调控的可变剪接。高通量测序的结果表明,AGO2参与调控了83.4%基因的剪接事件,其中76.5%与小分子RNA有关。利用RIP-seq的实验,找到与AGO2和hnRNP U共同结合的RNA,通过生物信息学分析预测出可能调控可变剪接的mi RNA。令人惊讶的是,这部分mi RNA与小分子RNA调控可变剪接靶基因的对应mi RNA高度一致,并且用RT-PCR实验证实了这部分高度一致的9条mi RNA的确参与了可变剪接,且证明了部分mi RNA对可变剪接的调控是依赖hnRNP U的。该9条mi RNA在3’端和5’端具有高度一致的共同基序以及调控可变剪接的共同特点。进一步的实验验证了阿霉素通过影响AGO2的核质分布影响了靶基因的可变剪接,这些可变剪接的改变导致功能性的转录本增加或减少可以为阿霉素的抑癌作用提供证据。最后,本研究利用数据库查找出多种细胞系中AGO2和hnRNP U的表达呈现负相关性。检测了4种细胞系,在肿瘤细胞中,AGO2表达量较高,hnRNP U表达量较低,而正常细胞中AGO2表达量降低,hnRNP U表达大量提高,这一现象会对可变剪接产生不同的影响,从而调控与肿瘤相关的转录本的表达量,进而影响肿瘤发生。综上所述,本论文以研究RISC核心组分AGO2的细胞核内功能入手,着眼于核内RNA干扰机制与可变剪接两种重要的分子机制之间的关系展开研究。利用生物信息学分析与分子生物学实验相结合的方法,落脚于小分子RNA调控可变剪接的机制,找到具体调控可变剪接的mi RNA与靶基因。全文最终以调控靶基因可变剪接的角度解释抗癌药物阿霉素的作用机制。