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原发性肝癌是常见的恶性消化道肿瘤之一,目前在我国肿瘤发病率中居第四位,病死率居第三位,严重威胁着人民群众的身体健康。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌)是原发性肝癌中最主要的病理类型。到目前为止,肝切除术和肝移植仍然是肝癌患者获得根治及长期生存机会最重要的治疗方法。但鉴于肝癌患者早诊率低,多数诊断时已为晚期,难以获得根治性手术的机会,而传统的放疗或系统化疗疗效不佳;并且即使其能接受手术,术后复发及转移率也较高,已然成为肝癌患者长期生存的主要障碍。近年来,大量研究表明:血管生成在促进肝癌细胞增殖、生长和侵袭转移等方面均起着举足轻重的作用。因此,抗血管生成治疗也成为晚期肝癌患者最有希望的策略之一。但在临床实际应用中,已确认有效的抗血管分子靶向治疗药物如:索拉非尼和瑞戈非尼,其疗效仍十分有限。因此,探索新的分子靶点来预测患者预后、预防其复发转移以及开发潜在有效的抗血管生成靶向治疗药物目前已成为肝癌领域的主要研究方向。泛素相关蛋白样因子 2(Ubiquitin associated protein 2-like,UBAP2L)是泛素相关蛋白家族的一个新成员,可与泛素广泛的结合,参与调控机体内多种细胞生理和病理过程。近年来,有关UBAP2L在肿瘤中的相关研究逐渐增多。有研究发现:UBAP2L在前列腺癌、胶质瘤、结直肠癌、肺腺癌以及肝癌等多种恶性肿瘤中呈高表达水平,且可密切影响着肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭转移等过程。但有关UBAP2L在肝癌中所发挥的分子生物学作用及详细分子机制尚不清楚。鉴于肝癌具有富血管性和高复发转移的特点,又有上述UBAP2L在多种肿瘤中的研究发现,因此,我们在安徽省自然科学基金(编号:1708085QH177)的资助下开展本课题研究,深入探索UBAP2L参与调控肝癌生长及转移的作用及潜在的分子机制,并揭示该基因的表达水平在肝癌患者中的生存预后意义,以期为寻找肝癌治疗的新靶点、新策略提供理论依据。第一部分UBAP2L在肝癌患者中的表达水平及其临床预后意义目的:近年来,越来越多的研究表明UBAP2L在多种恶性肿瘤中呈高表达水平,且与肿瘤的生长和转移密切相关。然而,UBAP2L表达水平与肝癌患者临床病理参数的相关性以及与患者预后的关系尚不清楚。因此,我们拟开展本项研究对上述存在问题进行探索。方法:结合生物信息学的预测结果(数据源于GEO和TCGA公共数据库)和我们的实验数据(包括免疫组织化学染色、western blot和实时定量PCR)进行分析,以验证UBAP2L在肝癌中的表达水平;进一步采用Kaplan-Meier单因素生存分析和Cox多因素生存分析确定UBAP2L表达水平与肝癌患者各临床病理参数及与患者生存预后的关系。此外,还初步探讨了 UBAP2L与肝癌血管生成相关指标的潜在联系。结果:与正常对照组相比,UBAP2L在肝癌细胞系和组织中均呈现高表达。Kaplan-Meier单因素生存分析显示:UBAP2L高表达的肝癌患者总生存时间(Overall survival,OS)明显低于 UBAP2L 低表达的患者(P =0.000)。同时,Cox多因素生存分析显示:UBAP2L高表达水平是肝癌患者总生存期预后不佳的独立预测因素(P=0.000)。另外,Pearson相关分析显示:UBAP2L表达与VEGF或MVD 呈显著正相关(r =0.460,P=0.000;r =0.387,P=0.000)。结论:UBAP2L在肝癌中呈高表达,且高表达UBAP2L的肝癌患者预后不佳。未来UBAP2L将有望成为肝癌新的潜在治疗靶点。第二部分UBAP2L对肝癌生长和转移的影响及其潜在分子机制目的:在第一部分研究结果的基础上,进一步探讨UBAP2L对肝癌生长和转移的影响及其潜在分子机制。方法:通过慢病毒介导的RNA干扰技术敲减肝癌细胞株SMMC-7721中的UBAP2L基因表达。然后,分别检测UBAP2L敲减后对肝癌各种细胞功能(包括细胞增殖、细胞周期、凋亡、克隆形成、划痕愈合、Transwell以及血管形成)的影响。此外,将UBAP2L敲减后的SMMC-7721转染细胞株种植在裸鼠皮下构建肝癌皮下移植瘤模型,体内层面观察UBAP2L敲减后对肝癌生长的影响。最后,利用全基因组表达谱芯片筛选和分析了 UBAP2L参与调控肝癌生物学功能的潜在分子机制,并采用western blot方法对显著富集通路中的关键分子进行验证。结果:与对照组比较,UBAP2L敲减组的肝癌细胞增殖和克隆形成数量明显减少,细胞周期被阻滞在G2/M期,凋亡细胞数明显增多,血管形成和细胞迁移能力明显减弱(P值均<0.05)。其次,UBAP2L敲低后可显著抑制体内裸鼠皮下移植瘤模型的肝癌生长。此外,全基因表达谱分析显示:UBAP2L敲减后总共有320个基因发生了显著的表达变化(P值均<0.05),其中有159个基因上调,161个基因下调。随后,David网站差异基因富集分析显示:在排名前10位的富集通路中,PI3K/AKT和P53信号通路富集最为显著。最后,western blot实验证实:UBAP2L敲减后可导致P21和PTEN水平增加,CDKl、CCNBl、p-PI3K和p-AKT水平降低。结论:UBAP2L在肝癌发生发展中起着促癌基因的作用,其表达下调可显著抑制肝癌的生长和转移,潜在机制可能与UBAP2L对PI3K/AKT和P53信号通路的调控有关。