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研究目的：检测miR-494在胰腺癌组织和细胞系中的表达,分析miR-494异常表达与胰腺癌临床病理特性的临床相关性；以胰腺癌细胞系AsPC-1, PANC-1为研究对象,证实miR-494对胰腺癌细胞增殖,周期,凋亡,侵袭转移,化疗敏感性等生物学特性的影响；进行miR-494与c-Myc和SIRT1相关性分析,明确miR-494靶向调控c-Myc和SIRT1;应用小片段干扰RNA (siRNA)技术抑制c-Myc与SIRT1基因表达,通过研究小片段干扰后PANC-1细胞增殖,周期,凋亡,侵袭转移等生物学特性的影响,进一步明确miR-494的作用机制是通过调控c-Myc和SIRT1实现。研究方法：实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测胰腺组(86例胰腺癌组织和41例正常胰腺组织)和胰腺癌细胞系(AsPC-1,Bxpc-3, PANC-1, SW1990, Miapaca-2)中miR-494的表达,分析miR-494的表达与胰腺癌临床病理学特征及其预后的相关性；以胰腺癌细胞系AsPC-1和PANC-1为研究对象,分别转染miR-494类似物(miR-494mimics)和抑制剂(miR-494inhibitor),实时定量PCR检测转染后miR-494的表达,以确定转染效果； MTT(二苯基溴化四氮唑蓝)和平板克隆观察上调miR-494后对胰腺癌细胞增殖的影响；蛋白免疫印迹(western blot)检测上调miR-494后细胞周期与凋亡相关基因P21,CyclinDl,BAX, Bc1-2,P53蛋白的表达；流式细胞术检测细胞周期变化和凋亡的变化；β-半乳糖苷酶染色(β-Galactosidase staining, β-Gal)测定细胞衰老；Transwell检测各组细胞迁移(Migration)和侵袭(Invasion)的影响,并用western blot检测迁移和侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(-P-9)的表达变化；采用MTT法检测AsPC-1和PANC-1细胞经上调miR-494后对5-氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他滨(Gemcitabine, GEM)化疗敏感性的变化；免疫组织化学染色法和实时定量PCR检测c-Myc和SIRT1在胰腺癌组织中的表达,用Graphpad软件对miR-494与c-Myc和SIRT1基因表达进行相关性分析；western blot检测转染miR-494mimics和miR-494inhibitor后c-Myc和SIRT1蛋白水平的变换,并对miR-494同c-Myc和SIRT1蛋白表达进行相关性分析；利用生物信息学预测软件(miRanda, miRDB and TargetScan)寻找miR-494与c-Myc和SIRT1的3’-非编码区结合(3’-UTR)结合位点,构建c-Myc和SIRT1双荧光报告基因质粒,通过双荧光报告初步证实miR-494直接靶向c-Myc和SIRT1;为了进一步明确miR-494的作用机制,以PANC-1为研究对象,小片段干扰RNA(siRNA)技术抑制c-Myc为siRNA-c-Myc,小片段干扰RNA(siRNA)同时抑制c-Myc与SIRT1为siRNA-c-Myc+siRNA-SIRT1(co-transfected,共转染组),对照为siRNA-NC(normal control), western blot检测转染后c-Myc和SIRT1蛋白的变化,以确定转染效果； MTT(二苯基溴化四氮唑蓝)观察各组对PANC-1细胞增殖的影响；蛋白免疫印迹(western blot)检测处理后细胞周期与凋亡相关基因P21, CyclinDl,BAX, Bcl-2,P53蛋白的表达；流式细胞术检测细胞周期变化和凋亡的变化；β-半乳糖苷酶染色(β-Galactosidase staining,β-Gal)测定细胞衰老；Transwell检测各组细胞侵袭(Invasion)的影响；BALB/c裸鼠成瘤实验鉴定上调miR-494和干扰c-Myc后PANC-1细胞的成瘤能力,western blot检测瘤体c-Myc和SIRT1的表达变化。实验结果：miR-494在胰腺癌组织的表达水平明显低于正常胰腺组织(0.567±0.049vs1.000±0.104,P<0.001)；同正常组织相比,miR-494在胰腺癌细胞系AsPC-1,Bxpc-3, PANC-1和SW1990中显著下降,在AsPC-1(0.171±0.023vs1.060±0.131, p=0.0026)和PANC-1细胞(0.270±0.024vs1.060±0.131,p=0.004)中下降最为明显；miR-494高表达患者的生存时间明显长于miR-494低表达患者(P=0.0366)。miR-494表达水平与胰腺癌患者年龄(p=0.0438)、肿瘤大小(p=0.0041)、TNM分期(p=0.0003)、淋巴侵袭(p=0.0010)、远处转移(p=0.0362)密切相关,而与肿瘤组织分化程度、患者性别、肿瘤部位、血管浸润、神经侵犯无相关性(p>0.05)。由于胰腺癌细胞系AsPC-1和PANC-1的miR-494表达水平下降最为明显,因此选取AsPC-1和PANC-1作为实验细胞系,转染miR-494mimics后,miR-494表显著上调(P<0.01),转染miR-494inhibitor后miR-494下调(P<0.05),证实转染有效。同各自的对照相比,转染miR-494mimics后AsPC-1(45.13±5.38％,P<0.01)和PANC-1(41.42±3.95％,P<0.01)细胞增殖受到显著抑制,转染miR-494inhibitor后AsPC-1(23.15±2.18％,P<0.05)和PANC-1(16.59±3.23％,P<0.05)细胞增殖增强。平板克隆结果显示,转染miR-494mimics后AsPC-1和PANC-1克隆数显著降低。流式细胞检测结果显示上调miR-494后,同各自对照相比,AsPC-1(12.3±0.5%vs19.5±0.6%,P<0.05)和PANC-1细胞(8.9±0.8%vs17.1±0.3%,P<0.05)细胞凋亡增强,AsPC-(63.3.1％vs73.7±2.5%,P<0.05)和PANC-1细胞(40.5.6±4.2%vs58.6±3.7%,P<0.01)细胞周期G1期细胞比率显著增加。同各自对照相比,上调miR-494后AsPC-1(17.5±2.1%vs40.7±1.7%,P<0.01)和PANC-1细胞(14.6±3.3%vs60.9±3.8%,P<0.01)衰老显著增加。Western blot检测显示经转染miR-494mimics后Bcl-2和CyclinDl显著下调,乙酰化p53.BAX和p21显著上调。Transwell检测各组细胞侵袭和迁移能力发现,上调miR-494后,AsPC-1和PANC-1细胞侵袭和迁移能力显著减弱,侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9显著下降。药敏结果显示,同各自的对照相比,在转染miR-494后,AsPC-1细胞对5-FU(7.93±1.05vs27.56±2.89ug/mL,P<0.01)和GEM(17.5±1.39vs82.56±4.27ug/mL,P<0.01)IC50值显著下降,PANC-1细胞对5-FU(9.41±1.63vs42.62±3.16ug/mL,P<0.01)和GEM(25.33±1.75vs63.25±5.36ug/mL, P<0.01)的IC50也显著下降,即上调miR-494后,AsPC-1和PANC-1对5-Fu和GEM的药物敏感性明显增强。免疫组织化学结果显示,胰腺癌组织中c-Myc(52.74±1.534％vs26.49±1.56％,P<0.001)和SIRT1(48.35±1.51％vs20.51±1.34％,P<0.001)阳性细胞数比率明显高于正常组织。实时定量PCR显示,同正常组织相比,胰腺癌组织中c-Myc(1.379±0.086vs0.940±0.070,P=0.0017)和SIRT1(1.583±0.0.110vs1-044±0.092,P=0.0022)基因高表达。胰腺组织中miR-494同c-Myc(r=-0.6799,P<0.001)和SIRTl(r=-0.5293,P<0.001)基因表达负相关,提示miR-494可能调控c-Myc和SIRT1.生物信息学预测软件(miRanda, miRDB and TargetScan)显示,miR-494与c-Myc和SIRT1的3’-UTR有共同的结合位点,提示miR-494可能靶向c-Myc和SIRT1.转染miR-494mimics后c-Myc和SIRT1基因和蛋白表达均显著下调,转染miR-494inhibitor后c-Myc和SIRT1基因和蛋白表达均上调。对miR-494同c-Myc和SIRT1基因表达的相关性分析提示：miR-494同c-Myc (r=-0.6374,P=0.0142)和SIRT1(r=-0.5973, P=0.0239)负相关。miR-494mimics与包含野生型c-Myc或SIRT1的3’-UTR质粒共转染的荧光活性明显低于对照组,证实miR-494直接靶向c-Myc和SIRT1.转染c-Myc干扰小片段后,c-Myc和SIRT1显著下降(P<0.01),细胞增殖受抑制,细胞G1期阻滞,细胞衰老增强,侵袭能力减弱(P<0.05)。然而siRNA-c-Myc组对细胞凋亡无明显影响(P>0.05)。提示miR-494的作用不单纯依赖c-Myc。共转染c-Myc和SIRT1干扰小片段后,同单独干扰c-Myc组相比,对增殖和侵袭抑制以及周期阻滞更为明显(P<0.01)。另外,共转染组组PANC-1细胞凋亡率增加(12.65±0.55%vs.16.85±0.75%,P=0.0457),凋亡和周期相关蛋白的结果同上调miR-494结果一致。提示miR-494的作用是通过同时靶向c-Myc和SIRT1实现。BALB/c裸鼠成瘤实验结果显示上调miR-494后PANC-1细胞的成瘤能力下降(0.83±0.18vs0.32±0.07g,P<0.05)。Western blot检测瘤体c-Myc和SIRT1的表达下调。实验结论：1.miR-494在胰腺癌组织中和胰腺癌细胞系的低表达,低表达miR-494与患者年龄,肿瘤大小,胰腺癌侵袭转移以及预后密切相关,检测miR-494的表达有助于判断胰腺癌恶性程度及预后。2.上调miR-494在胰腺癌细胞AsPC-1和PANC-1细胞中的表达,可显著抑制细胞增殖,增加凋亡和衰老细胞比例,发生G1期阻滞,减弱细胞侵袭和迁移能力,增强细胞对5-Fu和GEM的药物敏感性。提示miR-494可能作为胰腺癌基因治疗靶点。3.c-Myc和SIRT1在胰腺癌组织中高表达,并与miR-494负相关。在PANC-1细胞中,上调miR-494后,c-Myc和SIRT1表达下调；下调miR-494后,c-Myc和SIRT1上调；miR-494与c-Myc和SIRT1负相关。结合双荧光结果,证实miR-494直接靶向c-Myc和SIRT1。4.同时下调c-Myc和SIRT1在PANC-1细胞中的表达后,生物学效应及效应蛋白表达改变同上调miR-494一致；单一下调c-Myc后,凋亡未见明显改变,且对细胞增殖抑制和周期阻滞较下调c-Myc和SIRT1弱。提示miR-494可能通过靶向c-Myc和SIRT1发挥生物学效应。上调miR-494抑制胰腺癌细胞的体外成瘤能力。