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非酒精性脂肪肝（NAFLD）目前被认为是全球慢性肝病最常见的疾病之一。肝细胞中脂质的积累，与各种各样的毒素，药物和疾病发生有关。但近年来肝脂肪变性最常见的是与高脂饮食，菌群紊乱和高脂血症等代谢综合征相关，但其精确的病因尚不完全清楚。非酒精性脂肪肝和酒精性脂肪肝是极其相似的，只有是否有长期的饮酒史才能区分二者。由于患有NAFLD的病人相对于健康人能产生更多的内源性乙醇，研究人员怀疑两者之间的相似性并非偶然。基于此原因，我们猜测内源性乙醇可能就是引起NAFLD的主要原因之一。然而NAFLD患者肠道细菌产生的内源性乙醇在其血液中的浓度几乎是检测不到的，为了解释这些相互矛盾的结果，我们通过从ABS/NASH 患者体内分离出来的乙醇高产肺炎克雷伯菌株灌胃小鼠，诱导产生NAFLD，来解释内源性乙醇在NAFLD形成过程中的重要作用，并初步探索了高脂饮食诱导下乙醇高产菌株刺激会促进脂肪肝的形成并进一步产生肝纤维化，并研究其粪便代谢产物的变化情况等。
1. 肺炎克雷伯乙醇高产菌株的生物学特性研究
（1）通过对病人不同时期粪便进行16S rDNA的扩增子测序分析，发现其粪便中变形菌门中Klebsiella属细菌的丰度比健康对照组高约900倍，且宿主血液中乙醇含量的波动密切相。我们从粪便中分离得到85个耐酒精菌株，经鉴定主要包括Klebsiella pneumoniae，Providencia alcalifaciens，Escherichia coli等，并筛选出22株产乙醇能力在20mmol/L以上的菌株，结合粪便菌群的扩增子测序分析结果，挑选出两株乙醇高产肺炎克雷伯菌株W14和TH1，其可在含有2%葡萄糖的YPD培养基中培养8h，产乙醇能力高达47.73和43.47mmol/L（有氧条件），22.7和25.2 mmol/L（厌氧条件），远高于肺炎克雷伯标准菌株ATCC2146（15.6 mmol/L，5.4 mmol/L）。
（2）W14，TH1菌株经2%磷钨酸负染后在透射电子显微镜（TEM）下观察其形态为短杆状，有较厚的荚膜层，且可以利用乳糖发酵。W14 和 TH1 生长速度较快，可在6h后进入稳定期，平均生长速度约是标准菌株ATCC2146的1.5倍，并通过激光共聚焦显微镜观察其生物膜大约在16h左右开始形成。
（3）通过蛋白质组学分析发现差异蛋白与混合酸途径（2,3-丁二醇途径）密切相关。差异蛋白包括乙醇脱氢酶，乙酰乳酸脱羧酶，二乙酰还原酶和乙偶姻还原酶等关键酶的上调将可能会增加乙醇的产量，并且由于其生长速度很快，可能存在溢流代谢（overflow metabolism）现象，进一步解释了W14和TH1的产乙醇能力较高的原因。
2. 肺炎克雷伯诱导小鼠非酒精性脂肪肝模型建立及研究
（1）通过葡萄糖溶液刺激W14，TH1菌株喂养的小鼠，在2小时开始检测到血液乙醇的存在，并在4小时达到峰值（W14 111.16mg / L，TH1 75.65mg / L）。组织病理学显示W14，TH1和乙醇灌胃小鼠的肝小叶结构紊乱，肝脂肪细胞变性，并且从4周到8周脂肪变性逐渐加重，部分颗粒变性及点状灶性坏死，汇管区及其周围有炎症细胞浸润。灌胃8周后，菌株灌胃（W14，TH1）和乙醇灌胃小鼠血清AST，ALT含量和肝脏MDA，TG含量都显著高于对照组，这表明其肝细胞损伤程度大，并且肝脏内的脂肪沉积含量较高，与组织病理学切片结果相一致。与乙醇灌胃的小鼠相比较，这些菌株诱导的FLD（脂肪肝）小鼠显示了相同的组织病理学表现，表明由菌株产生的内源性乙醇可能导致与长期乙醇摄入类似的肝脏疾病。
（2）代谢组学研究发现有6种主要代谢物在菌株灌胃的小鼠粪便中持续升高了丰度，其中部分出现在乙醇喂养的小鼠中，这些代谢产物主要与乙醇代谢，脂肪代谢，氮代谢，初级胆汁酸生物合成，丁酸代谢，逆向内源性大麻素信号转导以及乙醇产生相关的关键途径上调有关。灌胃的Kpn菌株通过2,3-丁二醇发酵途径产生大量的内源性乙醇以及2,3-丁二醇，这些醇很难完全转化为乙醛和乙酸，或在肠 - 肝轴中通过非酶促代谢反应生成脂肪酸甘油酯，并导致随后的肝组织损伤及肝脂肪变性。
3. 应用基因表达谱芯片筛选NAFLD发生相关基因的研究
通过对差异表达基因的富集分析发现，菌株灌胃（W14，TH1）和乙醇灌胃小鼠涉及脂肪酸代谢，乙醇代谢，免疫和炎症因子，癌症相关因子以及Oflr基因家族的基因上调，包括参与脂肪酸代谢的hsd，ugt和cyp基因家族。我们发现了类固醇激素生物合成，不饱和脂肪酸生物合成，PPARα，视黄醇代谢，花生四烯酸代谢等途径上调，增加游离脂肪酸的产生，引起线粒体功能障碍，促进肝脏中的ROS 的生成增多。同时，与乙醇分解代谢有关的基因上调，表明肝脏清除过量乙醇以抵抗其在体内的积累，这与AFLD疾病进展的结果相一致。
4. 高脂饮食协同诱导小鼠非酒精性脂肪肝及其粪便代谢组学的研究初探
基于乙醇高产菌株诱导小鼠产生非酒精性脂肪肝的基础上，高脂饮食可能会导致菌群紊乱，进一步加重肝脏损伤，肝脏不能有效的分解菌群紊乱产生的肠源性化合物，导致其在体内积聚，从而诱发NAFLD进一步发展为肝纤维化。与对照组相比，W14组小鼠粪便中显著升高的代谢产物有24种，主要有短链脂肪酸，氨基酸，不饱和脂肪酸等。并将这些升高的差异代谢产物通过KEGG富集分析，共找到16个代谢通路显著上调。合并现代饮食中含有大量的脂肪以及久坐不动的生活方式都可能导致肠道菌群的异常代谢，以及肠道来源的内源性乙醇的积累会增加肝脏负担并诱发非酒精性脂肪肝风险，因此调节肠道微环境恢复到正常状态，是未来研究的关键领域。
1. 肺炎克雷伯乙醇高产菌株的生物学特性研究
（1）通过对病人不同时期粪便进行16S rDNA的扩增子测序分析，发现其粪便中变形菌门中Klebsiella属细菌的丰度比健康对照组高约900倍，且宿主血液中乙醇含量的波动密切相。我们从粪便中分离得到85个耐酒精菌株，经鉴定主要包括Klebsiella pneumoniae，Providencia alcalifaciens，Escherichia coli等，并筛选出22株产乙醇能力在20mmol/L以上的菌株，结合粪便菌群的扩增子测序分析结果，挑选出两株乙醇高产肺炎克雷伯菌株W14和TH1，其可在含有2%葡萄糖的YPD培养基中培养8h，产乙醇能力高达47.73和43.47mmol/L（有氧条件），22.7和25.2 mmol/L（厌氧条件），远高于肺炎克雷伯标准菌株ATCC2146（15.6 mmol/L，5.4 mmol/L）。
（2）W14，TH1菌株经2%磷钨酸负染后在透射电子显微镜（TEM）下观察其形态为短杆状，有较厚的荚膜层，且可以利用乳糖发酵。W14 和 TH1 生长速度较快，可在6h后进入稳定期，平均生长速度约是标准菌株ATCC2146的1.5倍，并通过激光共聚焦显微镜观察其生物膜大约在16h左右开始形成。
（3）通过蛋白质组学分析发现差异蛋白与混合酸途径（2,3-丁二醇途径）密切相关。差异蛋白包括乙醇脱氢酶，乙酰乳酸脱羧酶，二乙酰还原酶和乙偶姻还原酶等关键酶的上调将可能会增加乙醇的产量，并且由于其生长速度很快，可能存在溢流代谢（overflow metabolism）现象，进一步解释了W14和TH1的产乙醇能力较高的原因。
2. 肺炎克雷伯诱导小鼠非酒精性脂肪肝模型建立及研究
（1）通过葡萄糖溶液刺激W14，TH1菌株喂养的小鼠，在2小时开始检测到血液乙醇的存在，并在4小时达到峰值（W14 111.16mg / L，TH1 75.65mg / L）。组织病理学显示W14，TH1和乙醇灌胃小鼠的肝小叶结构紊乱，肝脂肪细胞变性，并且从4周到8周脂肪变性逐渐加重，部分颗粒变性及点状灶性坏死，汇管区及其周围有炎症细胞浸润。灌胃8周后，菌株灌胃（W14，TH1）和乙醇灌胃小鼠血清AST，ALT含量和肝脏MDA，TG含量都显著高于对照组，这表明其肝细胞损伤程度大，并且肝脏内的脂肪沉积含量较高，与组织病理学切片结果相一致。与乙醇灌胃的小鼠相比较，这些菌株诱导的FLD（脂肪肝）小鼠显示了相同的组织病理学表现，表明由菌株产生的内源性乙醇可能导致与长期乙醇摄入类似的肝脏疾病。
（2）代谢组学研究发现有6种主要代谢物在菌株灌胃的小鼠粪便中持续升高了丰度，其中部分出现在乙醇喂养的小鼠中，这些代谢产物主要与乙醇代谢，脂肪代谢，氮代谢，初级胆汁酸生物合成，丁酸代谢，逆向内源性大麻素信号转导以及乙醇产生相关的关键途径上调有关。灌胃的Kpn菌株通过2,3-丁二醇发酵途径产生大量的内源性乙醇以及2,3-丁二醇，这些醇很难完全转化为乙醛和乙酸，或在肠 - 肝轴中通过非酶促代谢反应生成脂肪酸甘油酯，并导致随后的肝组织损伤及肝脂肪变性。
3. 应用基因表达谱芯片筛选NAFLD发生相关基因的研究
通过对差异表达基因的富集分析发现，菌株灌胃（W14，TH1）和乙醇灌胃小鼠涉及脂肪酸代谢，乙醇代谢，免疫和炎症因子，癌症相关因子以及Oflr基因家族的基因上调，包括参与脂肪酸代谢的hsd，ugt和cyp基因家族。我们发现了类固醇激素生物合成，不饱和脂肪酸生物合成，PPARα，视黄醇代谢，花生四烯酸代谢等途径上调，增加游离脂肪酸的产生，引起线粒体功能障碍，促进肝脏中的ROS 的生成增多。同时，与乙醇分解代谢有关的基因上调，表明肝脏清除过量乙醇以抵抗其在体内的积累，这与AFLD疾病进展的结果相一致。
4. 高脂饮食协同诱导小鼠非酒精性脂肪肝及其粪便代谢组学的研究初探
基于乙醇高产菌株诱导小鼠产生非酒精性脂肪肝的基础上，高脂饮食可能会导致菌群紊乱，进一步加重肝脏损伤，肝脏不能有效的分解菌群紊乱产生的肠源性化合物，导致其在体内积聚，从而诱发NAFLD进一步发展为肝纤维化。与对照组相比，W14组小鼠粪便中显著升高的代谢产物有24种，主要有短链脂肪酸，氨基酸，不饱和脂肪酸等。并将这些升高的差异代谢产物通过KEGG富集分析，共找到16个代谢通路显著上调。合并现代饮食中含有大量的脂肪以及久坐不动的生活方式都可能导致肠道菌群的异常代谢，以及肠道来源的内源性乙醇的积累会增加肝脏负担并诱发非酒精性脂肪肝风险，因此调节肠道微环境恢复到正常状态，是未来研究的关键领域。