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第一部分携带人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24载体的构建及表达鉴定目的：本文通过构建携带人MDA-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24载体,观察其在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达,探讨其对肝癌基因治疗的理论价值。方法：酶切质粒ZD55-IL24得到IL24连接到pClon9-INS-IL24,将pClon9-INS-IL24共酶切得到INS+IL24片段,装入SG502-△CR2载体中,获得重组质粒pSG600-IL24,以Polyfect介导将其与腺病毒骨架质粒ppE3共转染293细胞,通过细胞内同源重组,生成携带人MDA-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24,同样的方法构建空载体SG600-EGFP。将其感染人肝癌细胞株HepG2、Hep3B、SMMC7721和正常的肝细胞L02, RT-PCR验证mda-7/IL-24基因的表达。结果：可见感染后的HEK293细胞出现特征性CPE,细胞变大、变圆、漂浮,呈葡萄串聚集。取克隆1和克隆2的病毒DNA各2μ1为模板,通过PCR方法扩增出约640bp的特异性片段,其大小与阳性对照相符,而阴性对照SG600-EGFP则无片段扩增。RT-PCR结果提示该载体能介导外源基因mda-7/IL-24在人肝癌细胞和正常肝细胞中高效表达。结论：成功构建了携带人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24载体,该载体能介导mda-7/IL-24基因在人肝癌细胞和正常肝细胞中高效表达。目的：观察携带人：mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24对肝癌细胞株HepG2. Hep3B、SMMC7721、MHCC97L、HCCLM3和正常的肝细胞L02的选择性抗肿瘤作用,为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法：将携带人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24感染肝癌细胞株HepG2、Hep3B、SMMC7721、MHCC97L、HCCLM3和正常的肝细胞L02。通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western-blot观察MDA-7/IL-24基因的表达,四甲基偶氮哩蓝染色法(MTT)观察肝癌细胞的生长抑制,Hoechst33258染色观察其对肝癌细胞的抗肿瘤作用,Annexin-V和PI双染后流式细胞仪检测细胞的凋亡,以及利用PI单染法流式细胞仪检测SG600-IL24对细胞周期的影响。结果：RT-PCR及Western-blot提示溶瘤腺病毒SG600-IL24能介导外源基因MDA-7/IL-24在肝癌细胞株HepG2、Hep3B、SMMC7721、MHCC97L、HCCLM3和正常的肝细胞L02中高效表达,ELISA检测结果提示细胞培养上清液中MDA-7/IL-24蛋白也明显增加,MTT结果表明SG600-IL24能明显抑制各种肝癌细胞的生长,Hoechst33258染色提示SG600-IL24促进肝癌细胞的凋亡,流式细胞仪提示SG600-IL24能选择性杀伤肝癌细胞,细胞周期分析提示MDA-7/IL-24阻滞肝癌细胞在G2/M期,而对正常的肝细胞没有明显的促凋亡作用和增殖阻滞作用。结论：携带人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24能特异性杀伤不同转移潜能的肝癌细胞和诱导凋亡,促进肝癌细胞增殖阻滞,而对正常肝细胞无明显的促进凋亡和增殖阻滞作用。第三部分溶瘤腺病毒SG600-IL24选择性杀伤肝癌细胞的机理探讨目的：探讨携带人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24对肝癌细胞株HepG2、HCCLM3的杀伤机制,为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法：用溶瘤腺病毒SG600-IL24干预肝癌细胞株HepG2、HCCLM3和正常肝细胞株LO2。通过RT-PCR和Western-blot蛋白印迹检测SG600-IL24干预后,肝癌细胞株HepG2、HCCLM3和正常肝细胞株LO2内不同时间点总STAT3以及信号通路下游信号分子C-myc、bax. bcl-2、bcl-xl、CyclinD2、Survivin、XIAP、OPN、MMP-2、MMP-9和VEGF基因和蛋白的表达变化,同时检测各细胞株在溶瘤腺病毒SG600-IL24处理后,磷酸化STAT3蛋白的表达变化。结果：RT-PCR和Western-blot结果提示STAT3以及信号通路下游信号分子C-myc、Bcl-xl、bcl-2、CyclinD2、Survivin、MMP-2、MMP-9、XIAP、OPN、VEGF基因和蛋白表达水平下调,而Bax基因和蛋白表达水平在溶瘤腺病毒SG600-IL24感染后上调。而磷酸化STAT3蛋白在感染后先上升后下降,在感染2小时达到峰值。.结论：溶瘤腺病毒SG600-IL24可能通过抑制STAT3及下游的信号通路来达到抗肝癌的作用,而正常肝细胞几乎不受此影响,使得溶瘤腺病毒SG600-IL24具有显著的选择性抗肿瘤效应。第四部分溶瘤腺病毒SG600-IL24和干扰素联合治疗裸鼠肝癌的研究目的：利用携带人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24与干扰素(Interferon, IFN)联合治疗肝癌裸鼠移植瘤,探讨病毒基因治疗和新辅助治疗相结合治疗肝癌的新方法。方法：首先建立裸鼠皮下种植肝癌模型,当肿瘤体积生长至100-150mm3，计为第0天,并将裸鼠随机分为4组,每组8只：(1)对照组：正常荷瘤裸鼠,每只裸鼠给予生理盐水0.3ml,右侧腹腔内注射,每天一次,共3次。(2)新辅助治疗组(IFN组)：IFN1.5×104IU/g/只,注射于右侧腹腔,每天一次,共10次。(3)基因治疗组(SG600-IL24组)：给予溶瘤腺病毒(SG600-IL24)治疗,肿瘤局部多点注射,每只2×108PFU/次,共5次,隔日一次。(4)基因治疗+新辅助治疗组(SG600-IL24+IFN组)：IFN的用法同前,SG600-IL24在IFN治疗结束后一天进行,SG600-IL24的用法同基因治疗组。并在干预30d后检测肿瘤组织中mda-7/IL-24基因和蛋白的表达,随后观察各组裸鼠生存时间及肿瘤体积的变化。结果：溶瘤腺病毒SG600-IL24介导的外源基因MDA-7/IL-24在基因治疗组和联合治疗组裸鼠体内表达明显增高,SG600-IL24+IFN联合治疗组裸鼠有3只生存时间超过120d,达到长期生存,与其他三组比较生存期明显延长(P<0.01); SG600-IL24+IFN组裸鼠肝癌体积也明显小于SG600-IL24组或IFN(P<0.01)。结论：溶瘤腺病毒SG600-IL24联合干扰素对裸鼠人肝癌种植模型有很好的协同抗肿瘤作用,为肝癌的基因病毒治疗提供了很好的前景。