CRISPR-Cas系统是原核生物抵御噬菌体和外来核酸入侵的防御系统,由规律成簇的间隔短回文重复DNA序列和编码相关Cas蛋白的基因组成。根据Cas效应蛋白功能复合物结构及特点的不同,可以将CRISPR-Cas系统分为两大类。其中,研究者发现并报道了新型第二大类Ⅴ型效应蛋白Cas12g,其宿主细菌源自温泉,故热稳定性高。此类蛋白具有特异性识别RNA底物的特点,有利于提高核酸诊断方法的性能,如在常温下进行RNA检测时不会改变其灵敏度。同时,Cas12g apo-form分子量仅89 kDa,相对较小的蛋白尺寸有助于其在体内转录组工程的应用。然而,目前对Cas12g效应蛋白结构与发挥功能的分子机制缺乏了解,严重限制该蛋白作为新型基因编辑工具的应用潜能,故本研究开展对Cas12g效应蛋白结构与相关功能分析。本研究通过大肠杆菌表达Cas12g效应蛋白,经Ni柱亲和层析、离子交换层析、分子排阻层析纯化获得目的蛋白,运用X-ray晶体衍射法解析Cas12g apo-form结构。Cas12g晶体结构整体上呈现双叶型分布,可分为REC Lobe和NUC Lobe;REC Lobe由REC1和REC2两大结构域组成。NUC Lobe由WED、RuvC及Nuc结构域组成。WED与RuvC结构域在蛋白质一级序列中分布不连续,但在三维空间的分布较为集中。随后,通过T7 RNA聚合酶的体外转录纯化获得目的sgRNA。将Cas12g效应蛋白、sgRNA和Target RNA按1:0.9:1.1摩尔比例混合孵育,纯化后获得Cas12g-sgRNA二元复合物与Cas12g-sgRNA-Target RNA三元复合物。体外制备的复合物用于晶体筛选与低温冷冻电镜样品的制备。经低温冷冻电镜数据收集与处理,获得3（?）分辨率的Cas12g-sgRNA二元复合物初始模型。基于目的蛋白与sgRNA的二级结构预测分析,探究Cas12g效应蛋白复合物的切割底物。利用凝胶迁移实验表明,Cas12g可以对ssRNA进行识别与切割,但无法对ds DNA底物进行识别与切割,而酶活突变后的Cas12g（D513A）则缺失此功能。结合Cas12g apo-form结构与Cas12g复合物结构（PDB:6XMF、6XMG）进行构象比对分析与蛋白质骨架的重叠比较,推测Cas12g发挥功能时的激活机制:在Cas12g效应蛋白结合靶RNA之前,有部分基序会覆盖于RuvC结构域的活性位点,起到盖子的作用,防止靶RNA进入相关活性中心;而sgRNA与靶RNA形成异源双链体的过程中,盖在RuvC结构域活性位点上的基序发生移动,暴露活性中心位点,进而招募非特异性RNA。本研究旨在通过解析Cas12g apo-form及其复合物结构,解释Cas12g蛋白被激活后发挥其RNase活性的结构基础和分子机理,为今后CRISPR-Cas12g系统的合理改造与应用提供结构基础和理论依据。