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目的:分析斯氏狸殖吸虫童虫、成虫排泄分泌产物(Excretory secretoryproducts,ESP)的蛋白分子量和抗原性,并对两者进行免疫组织定位,通过体内实验观察其活化小鼠腹腔巨噬细胞的类型。以ESP为特异诊断抗原,制备胶体金免疫层析试纸条,建立一种快速诊断并殖吸虫病的免疫诊断方法。
方法:(1)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离斯氏狸殖吸虫童虫ESP、虫体可溶性蛋白和成虫ESP、虫体可溶性蛋白,采用蛋白质印迹(Western blot)技术分别用肺吸虫病人血清、小鼠感染血清识别特异性反应条带,并用酶标免疫组织化学技术对ESP进行组织定位。(2)虫体抗原皮下免疫BALB／c小鼠,腹腔注射童虫ES抗原后不同的时间点收集腹腔巨噬细胞。用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的抗鼠甘露糖受体(Mannose Receptor,MR,又称CD206)抗体识别巨噬细胞上的膜受体,通过共聚焦显微镜观察细胞表面荧光强度。半定量PCR分析诱导性一氧化氮合酶(inducible NO synthase,iNOS),精氨酸酶(arginase-1),CD206的基因表达情况。(3)还原法制备胶体金溶液,并用透射电子显微镜和紫外可见分光光度仪对胶体金颗粒的粒径、聚集情况、与兔抗人IgG的结合情况进行检测,制备出均匀的、分散的高质量胶体金。用斯氏狸殖吸虫ES抗原和葡萄球菌A蛋白喷于带背衬的硝酸纤维素膜,分别作为检测线、质控线。用胶体金标记的兔抗人IgG去检查病人血清中的抗体。
结果:(1)经SDS-PAGE分离斯氏狸殖吸虫的虫体可溶性蛋白和ESP,Western blot分析显示,病人血清识别的童虫ESP主带在28、70kDa,成虫ESP主带在90kDa处；小鼠感染血清识别的童虫ESP主带在28、70kDa,成虫ESP主带在45、70kDa处。童虫ESP主要定位在后尾蚴的排泄囊,成虫ESP主要定位在成虫肠腔上皮。(2)激光共聚焦显微镜检测到活化巨噬细胞表面绿色荧光,且在第3天时荧光值最强。RT-PCR检测到ESP活化小鼠腹腔巨噬细胞有arginase-1、CD206基因表达,但不表达iNOS。(3)用胶体金免疫层析试纸条检测肺吸虫病血清54份,健康人血清34份,其敏感性是94.44％(51／54)特异性是94.22％(32／34),与ELISA检测法相比没有就较大差异。检测血吸虫病人血清25份和肝吸虫病人血清15份,其交叉反应率分别为4％(1／25)和6.67％(1／15)。试纸条在4℃至少可以保存6个月。
结论:28、70kDa的童虫ESP可能为斯氏狸殖吸虫的特异诊断抗原。ESP可替代性活化小鼠腹腔巨噬细胞。胶体金免疫层析试纸条操作简便,快速,不需要仪器设备,适用于现场大规模检测。