玉米黄粉的酶解工艺与抗氧化活性肽的制备

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玉米黄粉是玉米湿法生产淀粉的副产物,含蛋白质62-71%。由于溶解性差等原因,限制了其应用。如果能把玉米黄粉的一部分进行深层次加工、改性,生产附加值高的玉米活性肽作为食品、食品基料或药品基料,可有效提高玉米黄粉的使用价值,增加玉米加工企业的经济效益。 本论文以玉米黄粉为研究对象,对其进行膨化和除淀粉预处理,研究并优化了玉米黄粉的酶水解条件,进行了玉米黄粉水解物中抗氧化活性肽的分离,建立了纳豆杆菌发酵玉米黄粉产生抗氧化活性肽的工艺,研究了玉米黄粉酶水解液的部分物性。 用SDS-PAGE方法证实,采用膨化和除淀粉的方法对玉米黄粉进行预处理可有效提高蛋白的水解度。底物浓度为5%(w/v)的膨化并除淀粉的玉米黄粉水解度较未处理原料提高8.29%。用RPC方法研究了预处理对玉米黄粉中醇溶蛋白结构变化的影响。图谱表明,膨化使α-醇溶蛋白的两个组分极性差别增加,使γ-*醇溶蛋白的亲水性增加;除淀粉处理使β-醇溶蛋白和γ-醇溶蛋白在提取时的相对提取率增加。 用碱性蛋白酶Alcalase、风味蛋白酶Flavourzyme和复合蛋白酶Protamex水解预处理后的玉米黄粉,确定了实验范围内各酶水解的适宜条件,用高分离度凝胶色谱柱Superdex peptidePE7.5/300测定了玉米黄粉水解物中肽的分子量分布。Alcalase酶解玉米黄粉的适宜条件为:底物浓度5%(w/v),加酶量与底物浓度之比E:S 3%,60℃,pH 8.5,120 min。在该条件下玉米黄粉的水解度为40.75%,水解物中可溶性蛋白含量24.85 mg/mL,抗氧化活性214.94U/mL,多肽分子量主要分布在365-1067 Da。Flavourzyme酶解玉米黄粉的适宜条件为:底物浓度5%(w/v),E:S 5%,50℃,pH 6.0,60 min。在该条件下玉米黄粉的水解度为18.20%,水解物中可溶性蛋白含量6.79 mg/mL,抗氧化活性272.43 U/mL,多肽分子量主要分布在254.04-964.94 Da。Protamex酶解玉米黄粉的适宜条件为:底物浓度5%(w/v),E:S 0.81%,50℃,pH 7.0,150 min。在该条件下玉米黄粉的水解度为16.10%,水解物中可溶性蛋白含量16.69 mg/mL,抗氧化活性102.52U/mL,多肽分子量主要分布在522-12500 Da。 用Alcalase、Flavourzyme和Protamex两两配合,研究了双酶分步水解玉米黄粉的效果。实验结果表明,双酶分步水解玉米黄粉的效果较单酶的好,第二个酶加入之前不需对第一个酶进行灭活操作,酶的加入顺序对水解的效果有较大的影响。Alcalase和Protamex、Alcalase和Flavourzyme分别顺次水解玉米黄粉,总水解度分别为55.13%和45.03%,与单酶水解相比有显著提高,但水解物抗氧化活性与单酶相比没有显著提高;Flavourzyme和Alcalase、Flavourzyme和Protamex分别顺次水解玉米黄粉,总水解度分别为16.81%和19.67%,与单酶水解相比没有显著提高,但水解物抗氧化活性分别为459.83U/mL和438.73U/mL,与单酶水解相比有显著提高。 用超滤、离子交换层析、凝胶层析和反相色谱对膨化并除淀粉的玉米黄粉水解物中具有抗氧化活性的肽进行了分离。水解液用超滤膜分级后,获得了大于20 kDa、20-10kDa、10-6 kDa和小于6 kDa的组分。用Q-Sepharose:Fast Flow强阴离子交换层析分离小于6 kDa组分的结果表明,水解液中具有抗氧化活性的肽种类达几十种。用Sephadex G-25凝胶层析、RESOLJRCERPC、SOtJRCE 5RPC和SunFire C18反相色谱顺次分离制备抗氧化活性肽,得到四个高纯度的活性肽,其中两个肽经Q-TOF2质谱测序,确定其氨基酸序列为Gln-Gln-Pro-Gln-Pro-Trp和Phe-Pro-Leu-Glu-Met-Met-Pro-Phe。经序列比对,确认是新的活性肽。用纳豆杆菌发酵膨化玉米黄粉生产具有抗氧化活性的多肽混合物具有可行性。以玉米浆为纳豆杆菌种子培养基原料的适宜培养条件为:玉米浆2%(v/v)、培养基初始pH 6.5、摇床转速180r/min、34℃、培养时间18 h。液态发酵适宜工艺条件为:膨化玉米黄粉浓度10%(w/v),34℃,初始pH 7.0,转速200 r/min,时间36 h。在此条件下,培养液可溶性蛋白含量达23.67mg/mL,抗氧化活性223.91 U/mL。优化条件的发酵动力学曲线表明,纳豆杆菌比生长速率在发酵4-8 h达到最大值0.311h<-1>,发酵液可溶性蛋白比生成速率在0-4 h达到最大值3.220 h<-1>,随后菌体比生长速率和可溶性蛋白比生成速率均逐渐降低。发酵液的SDS-PAGE表明,发酵初期生成了多种分子量在20000-97000 Da的蛋白质和少量小肽。随着发酵的进行,大分子量的蛋白逐渐减少,分子量低于20000 Da的小蛋白和肽数量增加。32 h发酵液的多肽混合物分子量主要分布在860-5300Da。 开展碱性蛋白酶Alcalase水解膨化并除淀粉的玉米黄粉时,加酶量和水解时间对水解液部分物性影响的研究结果表明,与未水解玉米黄粉相比,其酶水解物的溶解性得到改善,加酶量为1-3%(w/w)(即24-72 mAU/g底物)范围内,反应120 min的水解物溶解性是未水解玉米黄粉的3.42-3.57倍。水解液粘度随水解时间加长而增加,但增幅不大。水解液的乳化性随水解时间加长而增加,乳化性最好的水解条件是加酶量72 mAU/g,水解60 min。水解液的乳化稳定性较未水解玉米黄粉的稍差,其值随水解时间的变化较小。水解液起泡性和泡沫稳定性随水解时间增加而增加,在加酶量60 mAU/g时,两性质明显高于其它加酶量;两性质最好的水解条件均是加酶量为60 mAU*/,水解90 min。 优化水解条件下,水解液物性随pH值变化的研究结果表明,水解液溶解性、粘度和乳化稳定性受pH的影响较小;在pH 3.0-6.0范围内,其乳化性、起泡性和泡沫稳定性变化不大,但在pH 6.0-9.0范围内,其乳化性、起泡性和泡沫稳定性明显增加。
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