新磷氮霉素A是我们实验室从金黄色链霉菌(Streptomyces aurats)AGR0001中筛选出的高效、低毒、无刺激性、低致敏性的新天然产物,具有抗作物病原真菌、抗病毒和抗肿瘤活性,在农药及医药方面具有极高的应用潜力。但是新磷氮霉素A的产量极低,阻碍了对其的进一步研发。了解磷氮霉素生物合成及其调控机制可为进一步对磷氮霉素的生物合成进行遗传改造、特异性地提高新磷氮霉素A的产量或得到结构新颖的类似物奠定基础。在本论文工作中,对S.auratus AGR0001中磷氮霉素的生物合成进行了研究。首先完成了磷氮霉素产生菌S.auratus AGR0001的全基因组测序并对其进行了生物信息学分析。通过序列同源性比对和分析,确定了磷氮霉素生物合成基因簇在基因组上的位置,经软件拼接和缺口重测序,得到了磷氮霉素完整的生物合成基因簇;对磷氮霉素生物合成关键基因进行了分析,并绘制了磷氮霉素生物合成基因簇基因组成结构图,推测了磷氮霉素的生物合成路线。对S.auratus AGR0001进行了相关遗传操作研究,找到了将外源DNA导入的最佳方法。成功地扩增并克隆了 21个与磷氮霉素生物合成相关的基因,并在大肠杆菌中成功构建了其中15个基因的敲除突变。通过接合转移将所构建的基因敲除突变导入S.auratus AGR0001中,构建了 4个基因敲除突变株。对这4个突变株进行了产物检测和活性实验,均无磷氮霉素产生及抗真菌活性,表明这4个基因都参与了磷氮霉素的生物合成。利用RT-PCR对orf5和nsdA两个基因的调控作用进行了研究。在野生型菌株中磷氮霉素生物合成基因簇中绝大部分基因从第1天到第9天都有表达,而在两个突变株中从第3到第9天与后修饰相关的基因均未见表达,说明这些后修饰基因的表达受Orf5和NsdA的正调控。调控基因orf27在突变株△ orf5中未检测到表达,说明该基因也受到Orf5的正调控。调控基因orf1和orf3在第3天和第5天在两个突变株中均有表达,表明它们的表达不受Orf5和NsdA的调控。另外调控基因orf5在突变株△nsdA中除第一天外都检测到了较高水平的表达,说明NsdA对其不起调控作用。此外,RT-PCR检测结果还表明,磷氮霉素生物合成基因簇基因整体表达水平较低,这与野生型菌株中磷氮霉素产量很低一致。将基因簇里的5个调控基因在大肠杆菌中进行了异源表达,重组蛋白都是以包涵体的形式存在。纯化了其中3个调控蛋白Orf1、0rf4和Orf5,并利用凝胶阻滞实验分析了这3个调控蛋白与其可能的靶基因序列在体外的结合,发现在现有条件下这三个调控蛋白都不能与其可能的靶基因序列结合。本论文工作对磷氮霉素的生物合成进行了初步研究,建立了产生菌的遗传操作体系,通过全基因组测序和生物信息学分析,找到了磷氮霉素生物合成的完整基因簇,并阐明了部分基因在其生物合成途径中的作用,为后续继续开展磷氮霉素的调控机制或后修饰机制的研究奠定了基础,对今后通过遗传改造提高新磷氮霉素A的产量具有重要的借鉴作用。