论文部分内容阅读
灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)和蓖麻葡萄孢(Amphobotrysricini(Buchw.)Hennebert)是许多重要经济作物和园艺作物的病原真菌。灰葡萄孢可以侵染1400多种植物,蓖麻葡萄孢主要侵染大戟科植物,二者均引起植物灰霉病,造成巨大经济损失。本文从真菌病毒的角度出发,从119个灰葡萄孢菌株和180个蓖麻葡萄孢菌株中筛选RNA病毒,发现1种新的与灰葡萄孢弱毒相关的dsRNA病毒Botrytis cinereaRNAvirus1(BcRV1)和1种新的在蓖麻葡萄孢中普遍存在的+ssRNA病毒Amphobotrysricinihypovirus 1(ArHV1)。取得的主要研究结果包括:本研究明确了 BcRV1的生物学和分子特性。BcRV1的基因组全长8952 bp,其正链RNA序列含有2个重叠的开放阅读框,ORF1和ORF2,分别编码1个假定多肽(P1)和依赖于RNA的RNA复制酶(RdRp)。ORF1和ORF2连接处存在1个典型的“移码七聚体-间隔区-H型假结”的-1移码区域,命名为KNOT因子。本研究通过在大肠杆菌中表达含有ORF dsRed-KNOT-eGFP的质粒pET-28a(+)-RKG,产生RFP-GFP融合蛋白,验证了 BcRV1的-1移码序列的功能。BcRV1的基因组结构、P1和RdRp与7个分类地位尚不明确的dsRNA病毒GaTV2、FgV3、FvV1、FvV2、PgV2、PiRV3和SsNsV-L类似。BcRV1与GaTV2和SsNsV-L关系最近,系统发育分析表明BcRV1与上述病毒单独聚成一支,该病毒类群可能代表一个新的真菌病毒科。BcRV1能够通过寄主真菌产生分生孢子,垂直传播到后代菌株中。BcRV1也能够通过菌丝接触,水平传播到营养体亲和或不亲和的其它灰葡萄孢菌株中。BcRV1的侵染与灰葡萄孢弱毒密切相关,且呈剂量-效应关系。在相同的遗传背景下,灰葡萄孢菌株中BcRV1的积累量与菌株菌丝生长和致病力呈负相关。BcRV1的侵染导致灰葡萄孢弱毒的可能机制是降低寄主真菌侵染垫形成能力。本研究发现铁苋菜是蓖麻葡萄孢的一种新寄主植物,并明确了这一病菌在铁苋菜上的发生规律。铁苋菜灰霉病在湖北省广泛发生。2011年10月,湖北省14个市(县/镇)的铁苋菜灰霉病平均发病率为18.6%;2012年10月,鄂州市铁苋菜灰霉病发病率高达100%;2013年10月,汉川市铁苋菜灰霉病发病率高达90%。本研究通过柯赫氏法则验证,证明铁苋菜是蓖麻葡萄孢的新寄主。本研究通过调查2012年和2013年鄂州市和汉川市铁苋菜灰霉病的田间流行情况,发现蓖麻葡萄孢引起的铁苋菜灰霉病在夏末秋初高温条件下流行。2012年调查结果表明,在日平均气温25～28℃的条件下,蓖麻葡萄孢能在铁苋菜上完成分生孢子产生、传播再侵染和菌核形成这一病害流行阶段。比较蓖麻葡萄孢和灰葡萄孢菌丝和分生孢子对温度的适应性,发现蓖麻葡萄孢较灰葡萄孢更耐高温。蓖麻葡萄孢菌丝生长最适温度范围为20～30℃,灰葡萄孢菌丝生长最适温度为20℃;在30℃下,蓖麻葡萄孢菌丝生长速度显著高于灰葡萄孢;在32℃高温下,蓖麻葡萄孢可以缓慢生长而灰葡萄孢不能生长。蓖麻葡萄孢分生孢子萌发最适温度(26～30℃)高于灰葡萄孢(20～26℃);在32℃高温下,蓖麻葡萄孢分生孢子萌发率为94%,而灰葡萄孢分生孢子萌发率为2.3%;在36℃高温下,蓖麻葡萄孢仍有5.3%的分生孢子能够正常萌发,而灰葡萄孢分生孢子不能萌发。本研究明确了 ArHV1的分子特性。ArHV1的基因组全长9232bp(除PolyA尾),其正链RNA序列含有1个大的ORF。ArHV1 ORF编码的多肽为RdRp,与低毒病毒科Betahypoviru 属病毒 CHV3、CHV4、P1HV1、SsHV1 和 VcHV1 的 RdRp 序列一致性较高,且含低毒病毒科和Fusariviridae科病毒RdRp的保守模体。系统发育分析表明ArHV1是低毒病毒科Betahypovirus属的一种新病毒。ArHV1在随机检测的167个蓖麻葡萄孢菌株中的出现频率为100%,不同菌株中ArHV1的积累量和序列存在一定的差异。ArHV1能通过蓖麻葡萄孢产生分生孢子,垂直传播到后代菌株中。菌株WHA-1的菌丝在侵染叶片时,病健交界处(菌丝顶端部位)ArHV1的积累量高于腐烂病斑处(菌丝较老的部位)的积累量,且在侵染叶片的菌丝中ArHV1的积累量高于腐生生长(PDA培养基上)菌丝中的积累量。ArHV1在蓖麻葡萄孢中存在DNA形态,DNA形态序列与cDNA序列高度保守。据作者所知,这是在蓖麻葡萄孢中发现真菌病毒的首次报道,在非逆转录RNA真菌病毒中发现DNA形态的第二例报道。上述研究结果丰富了感染植物灰霉病菌的真菌病毒种类,加深了对真菌病毒生物学的认识。