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研究背景:乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居女性恶性肿瘤发病率之首,死亡率位居女性恶性肿瘤致死率第二。根据肿瘤的基因表达特征,将乳腺癌分为4个亚型,分别为Luminal A型、Luminal B型、HER2过表达型、基底细胞样型/三阴性亚型。各亚型细胞的表面受体表达不同,其治疗方法和患者预后明显不同。三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）是指乳腺癌细胞均不表达雌激素受体（estrogen receptor,ER）、孕激素受体（progestrone receptor,PR）和人表皮生长因子受体2（HER2,Human Epidermal Growth Factor receptor 2）。TNBC因其患者预后差,复发转移率高受到广泛关注。白细胞介素-17（interleukin-17,IL-17）主要由Th17细胞产生分泌,是哺乳动物的免疫系统中的核心成员,有促进炎症发生发展的特性,可以作用于一系列炎症细胞,促进细胞因子、趋化因子、金属蛋白酶等的表达。近年来发现IL-17在肿瘤免疫和治疗预防中发挥着重要作用。在多种组织中IL-17蛋白的表达水平较低甚至不表达,却可见IL-17的mRNA的表达,因此本研究的目的在于建立一种可以有效检测IL-17 mRNA表达量的方法,并在TNBC中检测IL-17的表达量,研究IL-17与TNBC的关系,为探索TNBC的发病机制和TNBC的诊疗提供新的思路和方向。目的:1.探究TNBC与正常乳腺组织中IL-17表达是否存在差异。2.分析IL-17的表达与TNBC患者预后是否具有相关性。方法:1.新鲜乳腺组织标本的获取2016年1月到2017年3月从西京医院甲乳血管外科获取新鲜人乳腺组织标本,冻存并保存于-80℃冰箱中,从中分离一部分组织,用福尔马林进行固定,用于送病理检测,以确定乳腺癌病理学类型。2.病理检测将已经固定好的标本组织进行石蜡包埋、苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色,在光镜下观察各组织标本的病理学变化,以便确定标本为乳腺癌或是正常乳腺组织。随后采用免疫组织化学染色法,进一步确定乳腺癌组织为TNBC用以本研究。3.引物设计合成选择β-actin作内参,参考人源IL-17和β-actin在Genebank中的基因序列,用Primer 5软件进行分析并选取同源性高的区域用以设计本研究的引物,将设计好的引物序列交由TakaRa（中国）生物公司合成。4.总RNA的提取和反转录采用Trizol法提取组织标本的总RNA,用NanoDrop核酸蛋白测定仪对提取到的总RNA浓度进行测定。随后进行反转录合成cDNA,将产物保存于于-20℃冰箱中备用。5.IL-17及β-actin退火温度的确定根据Takara合成的IL-17和β-actin引物的Tm值,分别设置温度梯度43℃58℃和50℃60℃进行PCR,选择最佳退火温度。6.实时荧光定量PCR反应以反转录得到的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR反应,随后用琼脂糖凝胶电泳法对扩增得到的产物进行鉴定。7.乳腺组织中IL-17 mRNA表达量的测定利用所建立的实时荧光定量PCR法检测两组标本组织中IL-17和β-actin mRNA的初始模板量,以IL-17/β-actin作为两组标本中IL-17 mRNA的相对表达量,予以统计分析。8.免疫组化检测TNBC组标本Ki-67及E-cadherin的表达情况运用Image-Pro@Plus（IPP）高级图象分析软件进行图像信息分析,定量测定TNBC组织标本切片免疫组化的IOD值。9.IL-17 mRNA与Ki-67、E-cadherin的相关性分析将TNBC组织标本中IL-17mRNA表达和Ki-67、E-cadherin免疫组化定量指标IOD做相关性分析。10.分析TNBC患者组织中IL-17mRNA与临床病理特征之间的关系TNBC患者肿瘤组织中,IL-17的表达可能存在差异,为了进一步明确,对不同临床病理指标进行分层分析。结果:1.组织标本一般情况实验组及对照组标本经过术后免疫组化明确后,发现实验组中符合纳入条件的三阴性乳腺癌的标本16例,对照组符合纳入条件的为18例。2.IL-17和β-actin退火温度的确定分析PCR熔解曲线,按照Ct值越小-峰越高则灵敏度越高的原则,选择IL-17的最佳退火温度为49.3℃,β-actin的最佳退火温度为53.9℃。3.IL-17和β-actin RT-qPCR特异性对两个基因片段的PCR扩增熔解曲线和2%琼脂糖凝胶电泳结果进行分析,认为PCR过程中未发生非特异性扩增反应,且无引物二聚体产生,引物具有较高的特异性。4.IL-17和β-actin RT-qPCR敏感性对实时荧光定量PCR反应的结果进行分析后发现PCR的扩增效率相近;Ct值与起始拷贝数之间存在严格的线性关系。5.IL-17和β-actin RT-qPCR可靠性对IL-17和β-actin的标准曲线进行分析,发现IL-17的E值、R2值和斜率（Slope）分别为100.8%,0.997,-3.612,β-actin的E值、R2值和斜率（Slope）分别为97.9%,0.997,-3.579。6.IL-17和β-actin RT-qPCR的稳定性和可重复性对所有的Ct值进行汇总分析,随后计算重复5次检测结果的均数、标准差和变异系数（coefficient of variation,CV）。其中β-actin在稀释103倍时变异系数最大为2.04%,IL-17在稀释103倍时变异系数最大为1.95%,变异系数均小于2.5%,因此我们认为本研究所建立的RT-qPCR具有较好的稳定性和可重复性。7.RT-qPCR检测IL-17 mRNA对两组标本的RT-qPCR结果进行统计分析,用IL-17与β-actin的初始模板量之比作为各组IL-17 mRNA的相对表达量,结果显示TNBC组织IL-17基因相对表达为[6.98±0.54)×10-3],正常乳腺组织中IL-17的相对表达量为[（5.05±0.51）×10-3],TNBC组IL-17的表达量显著高于正常乳腺组织组,二者的差异有统计学意义（t=7.873,P=0.021,P<0.001）。8.TNBC组标本Ki-67及E-cadherin的表达及其与IL-17的相关性TNBC组中Ki-67的IOD值[19.33±2.61)×102];E-cadherin的IOD值[16.71±2.46)×102],Ki-67与IL-17 mRNA的相对表达呈明显正相关（P<0.001）,E-cadherin与IL-17 mRNA的相对表达呈明显负相关（P<0.001）。9.IL-17mRNA与临床病理特征之间的关系TNBC患者肿瘤组织中,IL-17的表达与腋窝淋巴结转移及临床分期不同均相关,腋窝淋巴结转移阳性及临床分期高均存在IL-17高表达（均P<0.05）。IL-17的表达与患者年龄、肿瘤直径、组织学类型均无相关（均P>0.05）。结论:成功建立了人源IL-17的Real-time qPCR的检测方法,TNBC组IL-17的表达量明显高于正常乳腺组织组,TNBC组患者标本IL-17 mRNA的相对表达与Ki-67呈明显正相关,与E-cadherin呈明显负相关,提示IL-17可能与TNBC患者预后不良相关。TNBC患者中腋窝淋巴结转移阳性及临床分期高均存在IL-17高表达,IL-17的表达与患者年龄、肿瘤直径、组织学类型均无相关。