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乙型肝炎病毒(HBV)持续感染是一世界性的卫生问题,慢性肝炎终至肝硬化甚至肝细胞癌的发生。随着疫苗的普遍接种及抗病毒药物的广泛应用,有效的降低了发病率及死亡率,但是也给人类带来一系列的问题:疫苗/诊断逃逸突变以及核苷类似物长期应用引发耐药导致检测和治疗的失败。这些突变株与野生株相比,在生物学特性方面必然有其特殊性。为了进一步了解突变株对病毒复制力、疫苗接种效能所带来的影响,以及研究核苷类似物的耐药机制、筛选新型药物,有必要建立全基因组的细胞模型。国内外研究表明,HepG2和Huh7细胞瞬时转染乙肝病毒质粒后,能够支持乙肝病毒的复制。然而,由于缺乏复制的稳定性,对药物筛选等高要求的实验是不适用的。HepG2.2.15细胞系是目前公认的应用最广泛的乙型肝炎细胞模型,并且被广泛应用于抗病毒研究。不仅病毒复制均衡、变异小,而且经多代培养仍可以长时间地维持病毒复制。但是病毒复制水平较低,并且不能人为控制。为解决目前面临的难题,有必要构建一个稳定的、可诱导表达的HBV突变株细胞系。四环素(Tet)诱导的基因表达系统是目前研究和应用最为广泛的真核细胞基因表达系统。本研究就是利用PCR、酶切等手段构建多个HBV全基因组突变株,转染前期已构建成功的tTA细胞系,用潮霉素筛选,构建多个突变株可调控性表达细胞系,并作为细胞模型检测已知的HBV抑制剂的作用。为进一步完善HBsAg诊断试剂盒及其变异监测、研究耐药机制、筛选新型抗病毒药物奠定了实验基础。本研究共分2部分完成。第一部分多种HBV突变株可调控性表达细胞系的构建目的:应用分子生物学技术,将HBV突变株克隆到pTRE2Hyg载体上,构建8个HBV全基因组突变株。通过转染前期实验构建成功的tTA细胞系,构建多种突变株可调控性表达细胞系,观察病毒表达情况,证明稳定复制能力及可调控性。方法:1应用PCR和酶切重组技术,在PCH-3093质粒P基因RT区B, C, D亚功能域173, 180, 181, 204, 236位点及S基因区100, 120, 145位点实现定点突变,并克隆到pTRE2Hyg载体上,构建具有潮霉素抗性的pTRE-HBV-A181T, pTRE-HBV-N236T, pTRE-HBV-A181T-N236T, pTRE-HBV-M204I, pTRE-HBV-L180M-M204V, pTRE-HBV-V173L-L180M -M204V, pTRE-HBV-G145R, pTRE-HBV-Y100C-P120T 8个质粒。2通过酶切及测序鉴定新构建质粒的正确性后,大量提取质粒。3前期实验已经成功构建了整合有ptTA2质粒的HepG2细胞系(G2TA2-7)。上述8个新构建质粒和pTRE-WMHBV分别转染此细胞,经潮霉素筛选,获得阳性细胞克隆。4分别经过PCR筛选出高分泌突变HBV DNA及WMHBV DNA颗粒的细胞系。5在无抗生素筛选条件下,连续传代20代,Southern blot观察其稳定复制能力,并挑选最佳细胞系。6细胞系可调控性的鉴定应用southern blot验证各细胞系在强力霉素去除或加入时HBV DNA的表达情况。7检测突变对病毒复制能力的影响应用质粒转染技术及Southern blot检测病毒复制能力的变化情况。结果:1成功构建了8个具有潮霉素抗性的突变株质粒。2转染后,经潮霉素筛选,分别获得60-100个细胞克隆。3分别挑选其中48个单细胞克隆进行扩大培养,经PCR检测细胞上清液中HBV DNA及WMHBV DNA,选取4个表达量较高者。4在无抗生素筛选条件下,继续传代培养20代(约4个月),通过southern blot检测,在细胞裂解液中能够形成HBV复制中间体,并且均强于G2.2.15细胞。最终选定A181T55, N236T13, A181T-N236T1, M204I43, L180M- M204V16, V173L-L180M-M204V44, G145R1, Y100C-P120T3, WMHBV42九个细胞株。5通过southern blot检测,证明了所构建的几个细胞系为可诱导性表达,即去除强力霉素时,细胞裂解液中能够形成HBV复制中间体;加入时则停止表达。6与野生株HBV相比,突变株M204I, M204V及N236T的复制能力明显下降;而L180M-M204V及G145R, Y100C-P120T变化不大。结论:成功构建了八个突变株和一个WMHBV可调控性表达细胞系,有助于研究某一基因在各个不同发育时期的功能,也为筛选新型抗病毒药物、完善检测方法奠定了实验基础。第二部分HBV突变株细胞系对常用的HBV抑制剂的敏感性研究目的:检测新构建的突变株及WMHBV细胞系对常用核苷类似物的敏感性。为完善检测方法及进一步筛选新型药物奠定了基础。方法:1通过Southern blot,检测新构建的核苷类似物耐药突变株对拉米夫定和阿德福韦酯的敏感性。2通过Native southern,检测新构建细胞系对拉米夫定和阿德福韦酯的敏感性。3通过质粒瞬时转染及Southern blot,检测阿德福韦酯理论耐药突变点对阿德福韦酯敏感性。4经PCR及基因测序技术,验证新构建细胞系的阿德福韦酯耐药突变位点。结果:1经Southern blot检测发现在A181T55, N236T13, A181T-N236T1及作为对照的野生型HBV株加拉米夫定组,随着药物浓度的不断加大,HBV复制中间体表达水平逐渐减弱;而L180M-M204V16, M204I43及V173L-L180M-M204V44三组细胞系,HBV复制中间体表达水平不因加拉米夫定而改变,并且不受药物浓度的影响;所有细胞系加阿德福韦酯组,包括A181T55, N236T13及A181T-N236T1均对阿德福韦酯敏感。2经Native southern发现,野生型HBV病毒株、G145R1, Y100C-P120T3及WMHBV42的复制水平均能被拉米夫定及阿德福韦酯有效的抑制;L180M-M204V16及M204I43拉米夫定组,病毒复制水平未见减弱;所有细胞系加阿德福韦酯组包括N236T13,复制水平均可见明显减弱。3经质粒瞬时转染及Southern blot检测发现,阿德福韦酯理论耐药突变点N236T,与野生型HBV相似,同样对阿德福韦酯敏感。4经基因测序,证实新构建细胞系A181T55的181位点、N236T13的236位点及A181T-N236T1的181和236位点上均有突变,并且突变与设计完全一致。结论:作为细胞模型部分验证了常见的HBV抑制剂的作用,为进一步筛选新型抗HBV药物、进一步构建动物模型、开展体内实验奠定基础。