利用生物正交化学反应在活体细胞内对生物大分子(如蛋白质)进行特异性标记的方法日益成熟起来。但是该领域大多数的工作集中在对特定条件下的新生成蛋白进行整体的组学研究,即所研究的对象和目标分子为一组蛋白质混合物(蛋白质组);且待测样品多为细胞裂解液或组织匀浆。而对特定目标蛋白分子的新生成情况尚没有较为成熟的分析方法。因此对蛋白质进行活体标记,进而研究新生成蛋白质、表征蛋白质的代谢状况具有重要意义。在本研究中,我们以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激Raw264.7细胞产生肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factorα,TNF-α)为体系,考察了在不同浓度的LPS和FBS、以及不同的刺激时间等条件下,LPS刺激Raw264.7细胞产生TNF-α的各项实验参数,确定了最优的实验条件:在含有1%胎牛血清的无Met的DMEM培养基情况下,分别用浓度为0和10 ng/m L的LPS刺激Raw264.7细胞4 h,在刺激细胞的同时掺入非天然氨基酸(Azidohomoalanine,AHA);并利用一价铜离子催化的叠氮基团与带有生物素(Biotin)标签的炔烃基团的环加成反应(Cu AAC),使蛋白质标记上Biotin标签,然后通过吸附在固相载体上的抗体将TNF-α分子特异性捕获后用偶联辣根过氧化物酶的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)对TNF-α分子上的Biotin进行识别,从而达到对特定的新生成蛋白质(TNF-α)进行检测的目的。然而,TNF-α属于分泌型蛋白,仅研究细胞裂解液中TNF-α的含量并不能准确的表征其新生成的情况,因此我们开发了胶内点击化学反应的新方法,通过SDS-PAGE电泳或2D-PAGE电泳去除样品中游离的AHA分子,利用点击化学反应使胶内的蛋白质标记上Biotin,然后用Streptavidin-HRP对新生成蛋白质上的Biotin进行识别,通过分别扫描某一蛋白质点的总体信号强度以及HRP的信号强度,从而达到对某一新生成蛋白质进行定性的目的。研究表明AHA对细胞没有毒性,但是任何外来物质掺入细胞后都会引起细胞内部的生理变化,因此我们利用液相色谱-质谱联用技术对掺入AHA的蛋白样品进行了分析,发现有87个差异极显著的上调蛋白,以及54个差异极显著的下调蛋白。本研究将为检测特定微量新生成蛋白、表征特定蛋白质的周转、寻找肿瘤标志物等方面提供可借鉴的方法。