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Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)和核苷酸结合寡聚化结构域蛋白(Nucleotide-binding oligo merization domain protein, NOD)是存在于细胞膜上或细胞内的模式识别受体,能够识别病原微生物进而启动信号通路,使细胞释放炎症因子,参与先天性免疫反应。成纤维细胞通常是一种不活跃的细胞,在乳腺中主要起到支持乳腺组织结构和修复损伤的作用。但是近年来研究发现,炎症时成纤维细胞受到某些刺激变得活跃,活化的成纤维细胞持续释放炎症因子,使炎症由急性转为慢性。研究成纤维细胞免疫的分子作用机制对乳腺炎的防控可能具有重要意义。本研究检测奶牛乳腺成纤维细胞中TLR和NOD的表达情况,并对细胞中TLR和NOD信号通路进行研究,从而初步揭示乳腺成纤维细胞的在先天性免疫方面的作用,为深入研究奶牛乳腺成纤维细胞免疫学机制提供实验依据。1.奶牛乳腺成纤维细胞的分离培养培养原代奶牛乳腺成纤维细胞采用组织块法。根据成纤维细胞和上皮细胞对胰酶敏感度不同,差时消化法连续纯化成纤维细胞。每天定时观察细胞的形态和生长情况,用纯化的成纤维细胞测生长曲线。吉姆萨染色鉴定细胞形态。结果显示：3-5 d开始有成纤维细胞从组织块周围向外游出,7d左右可见上皮细胞爬出组织块。2种细胞不混杂生长,存在着明显的界限。采用差时消化法对细胞进行3-5次纯化,可得到较为纯净的奶牛乳腺成纤维细胞。吉姆萨染色观测细胞形态呈长梭形,边缘光滑,排列疏松,区别于上皮细胞,可确定为奶牛乳腺成纤维细胞。结果表明从乳腺组织中成功分离出奶牛乳腺成纤维细胞。2.奶牛乳腺成纤维细胞TLR mRNA的表达及半定量分析RT-PCR检测脾脏组织中TLR1～TLR10 mRNA表达情况,应用半定量RT-PCR技术分析TLR1-TLR10基因mRNA在奶牛乳腺成纤维细胞中的表达水平。结果显示TLR1-TLR10在奶牛脾脏和乳腺成纤维细胞中均表达,其中TLR1、TLR3、TLR4和TLR5相对高表达,而TLR2、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10相对低表达(P<0.05)。结果表明奶牛乳腺成纤维细胞中TLR1～TLR10均有不同程度表达。3.奶牛乳腺成纤维细胞NOD mRNA的表达及半定量分析RT-PCR检测脾脏组织中NOD1和NOD2 mRNA表达情况,应用半定量RT-PCR技术分析NOD1和NOD2基因mRNA在奶牛乳腺成纤维细胞中的表达水平。结果显示,从奶牛脾脏和乳腺成纤维细胞中分别扩增出NOD1和NOD2基因的预期条带,NOD2.基因mRNA的表达量相对高于NODI (P<0.05)。结果表明奶牛乳腺成纤维细胞中NOD1和NOD2均有不同程度表达。4.奶牛乳腺成纤维细胞中TLR和NOD信号通路相关基因及其下游炎症因子mRNA表达检测采用RT-PCR方法检测奶牛乳腺成纤维细胞中MyD88、TRIF、TRAF6、IRAK1 IRAK4和NF-KB(p65)基因的mRNA表达,其次检测细胞中IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达。结果显示,TLR信号通路的接头蛋白MyD88、TRIF、TRAF6、IRAKI和IRAK4, TLR和NOD信号通路的转录因子NF-κB(p65)以及炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α在奶牛乳腺成纤维细胞中均表达。结果表明乳腺成纤维细胞中可能存在TLR和NOD信号通路。5.PAMP诱导对奶牛乳腺成纤维细胞中TLR4、NOD2、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达影响分别用lipid A(TLR4配体)和胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP) (NOD2配体)诱导奶牛乳腺成纤维细胞,RT-PCR检测实验组和对照组的TLR4(或NOD2)、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达量变化,结果显示,lipid A组TLR4、IL-6、IL-8和TNF-amRNA水平与对照组相比显著上升(P<0.05); MDP组NOD2、IL-6、IL-8和TNF-amRNA水平与对照组相比显著上升(P<0.05)。说明lipid A和MDP刺激细胞增强TLR4或NOD2以及炎症因子的表达,推测lipid A和MDP作用于奶牛乳腺成纤维细胞可能激活TLR4和NOD2的信号通路,导致炎症因子释放,促进炎症反应。