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目的:以Twist稳定转染的细胞株HEK-293-Twist为研究对象,观察其对化疗药物曲古菌素A(Trichostatin A,TSA)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5Fu)、紫杉醇(Taxol)的敏感性;分析Twist基因表达与耐药相关蛋白:拓扑异构酶II(TOPOII)、多药耐药相关蛋白(Multidrug Resistance Related protein,MRP)、肺耐药蛋白(lung resistance-related protein, LRP)、P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)及细胞粘附分子E-Cadherin基因的表达差异,为深入探讨Twist促进细胞药物抗性形成的机制提供实验依据。方法:(1)分别用pcDNA5/FRT/TO空载体和含有hTwist全长cDNA的pcDNA5/FRT/TO载体转染带有Flp-In-T-Rex系统的HEK-293细胞。用含有5μg/ml杀稻瘟素(blasticidin)和200μg/ml潮霉素B(hygromycin B)的培养基培养HEK-293细胞10d。存活的细胞用0.1μg/ml的四环素处理,检验HEK-293-Twist的可诱导表达能力,获得可诱导表达flag-Twist的细胞株HEK-293-Twist。含有空载体的细胞用同样的方法处理,作为对照。培养HEK-293-Twist和HEK-293-vector细胞,0.1μg/ml四环素处理,分别在2h,4h,6h,8h,10h,12h提取细胞总蛋白,Western blot检测HEK-293-Twist在诱导不同时间段Twist的表达量。(2)应用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)技术检测HEK-293-Twist和HEK-293-vector细胞分别对不同浓度TSA、5Fu、Taxol的敏感性,探讨两种细胞株对TSA、5Fu、Taxol药物敏感性差异。培养HEK-293-Twist和HEK-293-vector,分别分为对照组、曲古菌素A试验组、5-氟尿嘧啶试验组、紫杉醇试验组,每组3个复孔。每组细胞培养2d后,对照组更换普通培养基,TSA试验组分别更换为含有1μmol/L、4μmol/L、8μmol/L TSA的培养基;5-FU试验组分别更换为含有2.5μg/ml、12.5μg/ml、62.5μg/ml、312.5μg/ml 5-FU的培养基; Taxol验组分别更换为含有0.276μg/ml、1.38μg/ml、6.9μg/ml、34.5μg/ml Taxol的培养基;培养2d后加入CCK-8试剂,培养箱中继续培养4h,酶标仪450nm波长下测定吸光度。(3)应用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)方法,检测HEK-293-Twist和HEK-293-vector中Twist基因及耐药相关蛋白TOPOII、MRP、LRP、P-gp基因的表达差异,探讨Twist基因高表达与几种耐药相关蛋白基因表达的相关性。培养HEK-293-Twist和HEK-293-vector ,总RNA提取试剂盒提取两种细胞总RNA,经紫外分光光度计检测OD260/OD280及两种细胞中总RNA的含量,计算出两种细胞RNA的浓度。1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA完整性。采用逆转录试剂盒和随机引物将总RNA逆转录成cDNA,然后进行体外PCR扩增,采用GAPDH基因为内参照进行标准化。凝胶成像系统采集图像,应用Quantity one软件进行分析。(4)应用用免疫组化技术检测HEK-293-Twist和HEK-293-vector细胞中Twist、TOPOII、MRP、LRP、P-gp及细胞粘附分子E-Cadherin蛋白的表达。培养HEK-293-Twist和HEK-293-vector细胞,四环素诱导6h,采用免疫细胞化学方法染色Twist蛋白和TOPOII、MRP、LRP、P-gp、E-Cadherin蛋白,兔抗人Twist(1:500)、鼠抗人TOPOII(1:200)、鼠抗人多药耐药蛋白MRP(1:200)、鼠抗人P糖蛋白(1:200)、兔抗人肺耐药蛋白LRp(1:200)、鼠抗人E-Cadherin (1:200),设置阴性对照。行免疫组化染色后对结果进行图像分析。(5)应用蛋白质免疫印迹(Western Blot)方法检测HEK-293-Twist和HEK-293-vector中Twist及E-Cadherin的蛋白表达情况,探讨Twist与E-Cadherin蛋白表达的相关性。培养HEK-293-Twist和HEK-293-vector细胞,四环素诱导6h后,RIPA蛋白裂解液提取细胞蛋白并用考马斯亮蓝G-250法测定浓度,SDS-PAGE电泳分离,兔抗人Twist(1:500)、鼠抗人E-Cadherin抗体(1:200),Western Blotting检测各目的蛋白含量,根据Western印迹膜上蛋白条带灰度,采用Quantity One分析软件进行处理。结果:(1) WB结果显示,HEK-293-Twist细胞中Twist转染成功,并稳定表达,在四环素诱导6h后,Twist的相对表达量最高。(2)CCK-8结果显示:TSA、Taxol、5Fu对HEK-293-Twist和HEK-293-vector增殖均有抑制作用。Taxol、5Fu对两种细胞的抑制作用均随着药物浓度的增大而增强,但Taxol、5Fu对HEK-293-Twist增殖的抑制作用弱于对HEK-293-vector增殖的抑制作用(p<0.05),提示HEK-293-Twist对Taxol、5Fu的敏感性弱于HEK-293-vector。(3)RT-PCR结果显示:两种细胞中均有Twist、TOPOII、MRP、LRP、P-gp及E-Cadherin表达,Twist、LRP、P-gp在HEK-293-Twist中表达高于HEK-293-vector(p<0.05)。(4)免疫组化结果显示:Twist、P-gp、LRP蛋白在HEK-293-Twist的表达高于HEK-293-vector细胞, E-Cadherin蛋白在HEK-293-Twist的表达低于HEK-293-vector细胞(p<0.05)。(5)Western Blot结果显示E-Cadherin在HEK-293-Twist中表达低于HEK-293-vector细胞(p<0.05)。结论:(1)成功构建了可以稳定表达Twist的HEK-293-Twist细胞系。(2)高表达Twist的HEK-293-Twist细胞株表现出一定程度对Taxol、5FU的耐受。(3)Twist的高表达与耐药蛋白P-gp、LRP表达升高存在相关性,可能成为其促进细胞耐药形成的原因,具体机制尚待进一步研究。(4)HEK-293细胞中Twist与E-Cadherin的表达存在负相关。提示Twist在促进细胞耐药的同时,介导细胞粘附能力改变,可能在细胞耐药和转移中同步发挥作用。