论文部分内容阅读
普瑞巴林（Pregabalin）的化学名称为（S）-（+）-3-氨甲基-5-甲基己酸,它是一种抑制性神经递质γ-氨基丁酸（GABA）的3-位异丁基取代物。普瑞巴林最开始用于医治外周神经痛和辅助性治疗局限性的癫痫发作,后又普遍适用于多种其他的适应症。腈水解酶（Nitrilase,EC3.5.5.1）是一种重要的腈化合物转化酶,它能够通过一步反应将腈类化合物直接水解生成相对应的羧酸和氨。异丁基丁二腈（IBSN）经过立体选择性及区域性水解合成（S）-3-氰基-5-甲基己酸,再通过加氢还原得到手性化合物（S）-（+）-3-氨甲基-5-甲基己酸的路线是诸多化学-酶法合成普瑞巴林工艺中最优的原子经济性路线,其难点在于获得对底物IBSN具有高活性和高选择性的腈水解酶。本课题通过对各种固定化方法的尝试,选择出一种固定化综合效果较好的载体,用于固定化腈水解酶,并获得了比表面积高,质地坚固,可重复利用度高的固定化酶。通过对重组菌E.coli BL21/pET28b-NIT生长和产酶条件的研究发现,在发酵培养基中加入葡萄糖能使酶活提高到原来的1.96倍。在培养基中加入微量的Mg2+能够减少蛋白表达的包涵体的产生。在产酶过程中,培养基的初始pH值为7.5,最佳的诱导温度为28°C,加入诱导剂的时间为在接种后3 h,选择乳糖作为诱导剂,且诱导剂乳糖的浓度为12 g/L,在这些条件下,生物量达到2.80 g/L,比酶活达到95 U/g dcw。通过尝试不同的固定化方法将腈水解酶共价固定在载体表面制成固定化酶催化剂。本研究最终选择LX-1000EP（C）环氧树脂作为固定化载体对腈水解酶进行固定化,结果表明,最优固定化条件为:固定化温度为20°C,固定化时间为24 h,固定化过程中缓冲液类型选择磷酸钾缓冲液,pH 8.0,缓冲液浓度为0.1 M,加酶量为每克载体10 mL的粗酶液,酶液蛋白浓度为3 mg/mL。在此条件下固定化腈水解酶的酶活收率达到98.1%。通过对产腈水解酶的菌株E.coli BL21/p ET28b-NIT进行固定化,固定化后的腈水解酶催化异丁基丁二腈的选择性得到了提高,催化反应的最适温度和pH分别是35°C和8.0,固定化酶的温度和p H稳定性较游离酶都有明显的提高。固定化酶能在连续使用6次后仍能保持初始酶活的30%以上,R-异丁基丁二腈的外消旋化的收率达到80.9%以上,经过外消旋化后,异丁基丁二腈的光学纯度由90%降低为3.6%。