电压门控钙离子通道是一种广泛分布于生物细胞膜上控制钙离子内流的功能通道,由α1主要功能亚基、α2/δ、β和γ等多个辅助亚基组成的大分子复合蛋白。电压门控钙离子通道具有控制钙离子内流,稳定细胞的膜内外电压差的功能,在生物体内发挥着重要调节作用。α1亚基作为电压门控钙离子通道的主要亚基,在电压门控钙离子通道的运行以及调节等功能中起主导作用。目前对植物寄生线虫的电压门控钙离子通道的研究还较少,其结构和功能尚未确定。本文以马铃薯腐烂茎线虫为材料,使用RT-PCR和RACE技术克隆得到了马铃薯腐烂茎线虫3种不同类型电压门控钙离子通道α1亚基基因的cDNA序列,分别为DdCα1D,DdCα1G和DdCα1A。实验结果表明,DdCα1D基因为L型电压门控钙离子通道α1D亚基基因,全cDNA序列长为6236bp,ORF为5208 bp,编码1736个氨基酸GenBank的登陆号为MG585272;DdCα1A基因为P/Q型电压门控钙离子通道α1A亚基基因,全cDNA序列长为6676bp,ORF为6534 bp,编码2177个氨基酸,GenBank的登陆号为MG585271;DdCα1G基因为T型电压门控钙离子通道α1亚基基因,全cDNA序列长为6457bp,ORF为5988 bp,编码1996个氨基酸,Gen Bank的登陆号为MG585273。通过对电压门控钙离子通道α1亚基蛋白氨基酸多序列比对分析,获知马铃薯腐烂茎线虫与秀丽隐杆线虫的电压门控钙离子通道α1亚基具有极高的同源性,利用生物信息学预测已获得的马铃薯腐烂茎线虫三种钙离子通道α1亚基跨膜结构及功能域。结果显示,DdCα1D、DdCα1A和DdCα1G三个基因编码蛋白均具有四个跨膜结构域,每个跨膜结构域中含有6个α跨膜螺旋,属于电压门控钙离子通道α1亚基氨基酸序列的基本结构。高压敏感型电压门控钙离子通道DdCα1D和DdCα1A氨基酸序列具有与β亚基连接片段AID功能域、钙离子结合位点EF-hand功能域和钙调蛋白结合位点IQ motif功能域。在低压敏感型电压门控钙离子通道DdCα1G氨基酸序列上具有EF-hand功能域,而不存在AID和IQ motif功能域。通过RNA-DIG原位杂交实验初步确定各个类型的钙离子通道在马铃薯腐烂茎线虫中表达位置。RNA-DIG原位杂交实验结果表明DdCα1D基因主要表达于体壁肌肉和口针部位;DdCα1A基因主要表达于食道腺、阴门和输精管部位;DdCα1G基因主要表达于食道和中食道球部位。利用RNAi技术,通过dsRNA与荧光染料FITC共浴的浸泡处理方法,使得目的基因达到基因沉默的效果,从而推定各类型电压门控钙离子通道在马铃薯腐烂茎线虫中发挥的功能作用。经L-dsRNA处理48 h后,DdCα1D基因的相对表达量为33.54%,而线虫在基因沉默后主要表现为线虫僵直和蜷缩,并且运动缓慢、与对照处理相比通过沙柱速率显著下降。在P/Q-dsRNA处理48 h后,线虫DdCα1A基因的相对表达量为26.36%,在基因沉默后与对照处理组相比线虫主要表现为繁殖系数显著下降。在TdsRNA处理48 h后,DdCα1G基因相对表达量显著下降仅为14.64%,线虫在基因沉默后相对于空白对照主要表现为中食道球肌肉紧缩,从而抑制了线虫的取食量。