血清4型禽腺病毒（FAdV-4）的主要感染对象为3-5周龄的雏鸡,感染后在一周内会发病死亡。病死鸡剖检表现出心包积液-肝炎综合征（Hydropericardium-Hepatitis Syndrome,HHS）的典型症状,心包内积聚大量的液体,肝脏出现明显的病毒包涵体,死亡率达到30-80%。病毒的传染性强,除了通过接触和气溶胶的水平传播之外,FAdV-4还可以通过鸡胚进行垂直传播。自2015年以来,超强毒力的4型-禽腺病毒（hv FAdV-4）已成为国内肝炎-心包积液综合征（HHS）的主要的病原体,导致鸡群的死亡率的节节攀升,给中国的禽类养殖及相关产业带来了极大的威胁。在FAdV-4疫苗研究方面,虽然灭活疫苗和弱毒疫苗有着不错的保护力,但是这些疫苗在安全和价格等方面存在着无法避免的缺点,所以急需开发出一种安全、高效的新型疫苗对该病进行有效的防控。在致病机理和药物治疗研究方面,虽然FAdV-4已引起广泛关注,但病毒的致病机制仍然知之甚少,更没有针对于FAdV-4特异性治疗药物的研究。本论文首先分离超强毒力的FAdV-4毒株作为试验毒株,并探究了病毒造成肝细胞脂肪变性的机理。最后优化了酵母对Fiber-2蛋白的外分泌表达,并证明了该蛋白作为亚单位疫苗的可行性。本研究为发酵生产FAdV-4亚单位疫苗和特异性药物治疗的靶位点的确定提供了基础资料。具体结果如下:1.本文从2017年广东省25日龄的重症HHS肉鸡中分离到一株超强毒力的FAdV-4毒株（命名为GD616）。GD616株全基因组序列与我国新近分离的超强毒株FAdV-4高度同源,同时发现ORF19和ORF27发生了自然缺失。对FAdV-4超强毒株Fibre-2蛋白的分析表明,蛋白第378和453位独特的氨基酸残基可能与毒力有关,因为它只存在于所有超强毒力的FAdV-4分离株中。接下来LMH细胞中病毒复制规律的研究发现,当MOI为0.1 TCID50感染时,72 h后病毒的核酸、蛋白和滴度均达到了峰值。为了系统地评价日龄对超强毒FAdV-4易感性的影响,我们用该hv FAdV-4株对7日龄至180日龄无特定病原的雏鸡（SPF Chickens）进行了肌肉接种,以评价其致病性。试验结果表明,hv FAdV-4毒株GD616对鸡的致病性与日龄息息相关,59日龄及以下的雏鸡发病率和死亡率都可以达到100%,研究中最大日龄的鸡为180天,发病时仍表现出了HHS的典型病理变化,发病率和死亡率分别为60%和20%。这些发现丰富了目前有关超强毒FAdV-4病毒对不同日龄鸡致病性的现有知识,有助于选择合适的日龄鸡进行疫苗的评价。研究也为后续FAdV-4的亚单位疫苗和致病机理的研究提供毒株。2.FAdV-4是一种嗜肝病毒,可以造成肝脏严重的损伤,然而发病机制仍不清楚。在这里,我们发现在FAdV-4感染的鸡中,FAdV-4诱导的肝损伤伴随着肝细胞胞浆中油滴（甘油三酯）的积聚,发生了典型的脂肪变性。感染鸡的脂肪合成关键因子,如LXR-α、PPAR-γ和SREBP-1C等显著上调,低密度脂蛋白分泌、脂质氧化和脂质分解的关键因子显著下调。在体外鸡肝癌细胞（LMH）的病毒感染试验中,FAdV-4感染同样能诱导肝细胞内的脂肪变性,同时也伴随着各种脂肪代谢中相关因子的改变。还发现细胞内TG含量与病毒载量表现出显著的正相关。接下来我们进一步确定了LXR-α活性对FAdV-4诱导的脂肪变性的影响,发现LXR-α反向激动剂（SR9243）和RNA干扰（si-LXR-α）处理不仅减少细胞内油滴数量和成脂因子的表达,而且还使病毒DNA水平、蛋白表达和病毒滴度显著降低。LXR-α激动剂（T0901317）则表现出了完全相反的现象,油滴数量、成脂因子的表达、病毒DNA水平、蛋白表达和病毒滴度都出现了显著增加。但抑制LXR-α下游SREBP-1C蛋白的活性对病毒产量无明显影响。综上所述,FAdV-4诱导的脂肪变性依赖于LXR-α的激活及其对下游脂肪代谢关键蛋白的调节。并且LXR-α的活性和FAdV-4在细胞内的复制密切相关,但是这都是通过独立于SREBP-1C的信号通路实现。这些结果突出了靶向LXR-α通路治疗FAdV-4感染的潜力,为特异性药物研发提供了重要的启示。3.为了寻求一种高效的表达系统来研制4-型禽类腺病毒的亚单位疫苗,本论文利用毕赤酵母对Fiber-2蛋白进行了表达。首先根据酵母对于密码子的偏好将病毒的Fiber-2基因进行了优化,并通过p PIC9K质粒整合在酵母GS115菌株基因组中,最后采用3个不同浓度的G418进行筛选并获得了8个重组的高拷贝菌株。随机选取两个高拷贝重组菌株进行表达试验,结果显示研究成功获得外分泌表达Fiber-2蛋白的重组菌株。为了提高Fiber-2蛋白在酵母中的表达量,研究随后对诱导的条件进行了优化。结果表明,在摇瓶发酵中诱导的最佳甲醇浓度、时间和温度分别为1.0%（v/v）、72 h和30℃。优化后发酵液上清中的总蛋白量约为50 mg/L,Fiber-2蛋白的达到8.7 mg/L。随后经镍柱纯化得到条带单一的Fiber-2蛋白,再通过与佐剂（ISA-201-VG）1:1混合制备成亚单位疫苗免疫鸡群。结果表明,由优化后的毕赤酵母表达Fiber-2蛋白制备的亚单位疫苗免疫雏鸡后,可以诱导较高的抗体水平并提供高达100%的超强FAdV-4毒株（GD616）的攻击保护。本研究为进一步采用毕赤酵母表达的重组Fiber-2蛋白制备FAdV-4亚单位疫苗的研发奠定了基础。