中性氨基酸转运蛋白SNAT2(Sodium-coupled neutral amino acid transporter2)是SLC38基因家族(Solute carrier family38)编码的Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白，归属于System A。它在大脑的谷氨酸-谷氨酰胺循环、肝脏糖质新生等生物通路中发挥重要作用。SNAT2是内分泌和营养激发的最主要的调节异构体，其功能紊乱会导致许多神经性退行疾病。由于SNAT2具有重要的生理功能，近十几年来人们开始对其进行了结构与功能关系的研究，但是目前对于通过SLC38家族蛋白介导氨基酸转运的功能特性和结构基础仍然知之甚少。亲水性分析预测了SNAT2有11个跨膜螺旋区TM(Transmembrane Helices)，包含一个细胞内侧的N末端和细胞外侧的C末端，介导阴离子渗透电流，转运过程对pH变化敏感。由于SNAT2的晶体结构还没有报道，目前的研究主要基于与已知晶体结构的同源蛋白比较分析。　　 为了更方便地研究SNAT2在细胞中的表达和定位，采用PCR扩增和酶切技术将增强型绿色荧光蛋白EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)的C端与质粒pBK-CMV⊿-SNA T2中SNAT2的N端相连接，同时采用定点突变技术对EGFP和SNA T2基因之间的终止密码子进行了突变。通过酶切和测序验证得到pBK-CMV⊿-EGFP-SNAT2质粒。将构建好的质粒瞬时转染进人胚肾细胞(HEK293 cells)后用Western blot和激光共聚焦电子显微镜检测EGFP-SNAT2的表达与亚细胞定位。结果表明EGFP-SNAT2在细胞中正确表达并定位于细胞膜上。pBK-CMV⊿-EFP-SNAT2质粒载体的构建对于进一步研究SNAT2的结构和功能具有重要意义。　　 SNAT2的膜拓扑结构的研究主要包括三个方面，即N端和C端的定位、糖基化位点的位置确定以及跨膜结构域数量的确定。首先为了确定N和C端的定位，我们构建了标签蛋白HA分别位于SNAT2的N端和C端的两个载体即pBK-CMV⊿-HA--SNAT2和pBK-CMV⊿-SNAT2-HA，其中pBK-CMV⊿-SNAT2-HA为本实验室已构建获得的载体，N端载体pBK-CMV⊿-HA--SNAT2采用酶切连接的方法获得,并通过双酶切鉴定、DNA测序确定其正确构建，同时采用Western Blot方法确定HA-SNAT2能够正常表达。应用免疫荧光的方法通过AlexaFluor标记的HA荧光一抗检测SNAT2的N端和C端的定位。结果表明SNAT2的N端位于膜外而C端位于膜内，与以前的报道不同。　　 其次是对糖基化位点的确定。已有的文献预测了SNAT2的两个N糖基化位点即N258和N272。我们采用定点突变的方法将SNAT2分子中258和272位的谷氨酰胺突变成天冬酰胺(N258Q、N272Q和N258Q&N272Q)，DNA测序后进行Western Blot，结果显示SNAT2蛋白发生突变后在SDS-PAGE上的迁移率发生明显改变，表明这两个位点确为SNAT2的糖基化位点。但是无论单突变体还是双突变体与经过N-糖苷酶PNGase F消化后的SNAT2比较，在SDS-PAGE上的迁移率仍然存在差异。根据N糖基化位点本身的性质预测可能存在另外的糖基化位点N254，通过相同的方法验证确定N254也是一个N连接的糖基化位点。　　 最后是跨膜结构域数量的确定。未来我们将应用MTSEA-生物素标记的方法来最终确定跨膜结构域的数量。