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苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)4.0718菌株能够产生双金字塔形和立方体形晶体，它们分别由Cry1和Cry2原毒素组成。本研究在PCR-RFLP方法的基础上，对与Cry1原毒素相结合的20kb DNA上含有的晶体蛋白基因进行了鉴定。在此基础上，采用PCR方法扩增了该DNA片段上cry1Aa和cry1Ac基因的全长编码序列，并且对cry1Aa基因编码序列的PCR产物进行了克隆。 1．Bt 4.0718菌株伴孢晶体的选择性溶解与20kb DNA的提取对Bt 4.0718菌株产生的伴孢晶体在不同的条件下选择性溶解，然后对不同的原毒素组分进行SDS-PAGE和琼脂糖凝胶电泳，发现Cry1和Cry2原毒素均与20kb DNA相结合。与立方体形晶体相比，双金字塔形晶体溶解时所需的条件更温和。因此在溶解时，与Cry1原毒素相结合的20kb DNA没有发生降解。采用pH10.5的苯酚：氯仿在65℃下对与Cry1原毒素相结合的20kb DNA进行抽提，并用透析袋电洗脱法将这一大片段DNA进行有效的回收。 2．20kb DNA上cry基因的鉴定 采用cry1和cry2基因的通用引物对20kb DNA上的核酸序列进行初步分析，结果表明该片段上含有这两类基因，而且cry1基因的拷贝数要低于cry2基因的拷贝数。为了对cry基因的类型作进一步的鉴定，本研究对该DNA片段进行了PCR-RFLP分析。研究发现，该片段能够扩增出1.6kb和1.2kb的预期产物，而且1.6kb PCR产物的扩增量要低于1.2kb PCR产物的扩增量，这与通用引物的扩增结果一致。PCR产物的大小及其酶切结果表明20kb DNA上含有cry1Aa、cry1Ac、cry2Aa和cry2Ab基因。对cry1Aa和cry1Ac基因1.6kb PCR产物进行测序的结果与PCR-RFLP分析的结果相符。 3．20kb DNA上cry1Aa基因的克隆 在获得c理IAa和c粼IAc基因3‘端1.6kb和5‘端1.4kb PCR产物的基础上，设计了一对引物用于扩增得c粼IAa和c汀1A。基因的全长编码序列。将所得的3.skb PCR产物与pUCm一T载体连接，然后转化到大肠杆菌DH5a菌株，对随机挑取的转化子的重组质粒进行酶切分析及PCR一RFLP鉴定，确定其中含有c粼IA。基因。