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研究表明Thermomyces dupontii脂肪酶（简称TDL）在洗涤、生物柴油、油脂改性等领域具有很好的应用潜力,而天然菌T.dupontii培养过程复杂,脂肪酶发酵活力低,限制了TDL产业化应用。要使TDL实现产业化,必须通过高效制备技术降低其生产成本。除了发酵酶活,温度特性也是工业领域关注的技术指标,TDL在低温条件下相对酶活性低,在高温条件下热稳定性差,因此若想将TDL广泛应用到不同工业领域,需要优化其温度特性。本论文针对限制TDL产业化应用的难点,通过五个方面（启动子优化、信号肽优化、组合策略高效表达、温度理性设计以及TDL及其突变体应用）对TDL进行系统的研究,为TDL的产业化奠定基础。本论文的主要研究内容及结果如下:（1）不同启动子对重组TDL在毕赤酵母表达的影响:研究了15种甲醇诱导型启动子和9种组成型启动子对TDL在毕赤酵母重组表达的影响,在15种甲醇诱导型启动子中,启动子PFLD1效果最好,其次为PAOX1和PDAS1,这三种不同启动子重组菌在5 L发酵罐最高酶活分别为27076 U/mL,24159 U/mL和22342U/mL。在所选的9种组成型启动子中,启动子PGCW14效果最好,其次为P0472和PGAP,这三种组成型启动子重组菌在5 L发酵罐最高酶活分别为17353 U/mL,15046 U/mL和14276 U/mL。（2）不同信号肽对重组TDL在毕赤酵母表达的影响:在最佳启动子PFLD1的基础上研究了7种异源信号肽、8种同源信号肽、2种密码子优化α-MF信号肽以及8种α-MF信号肽突变体对TDL表达的影响。在这25种信号肽中,D57-74效果最好,其次为Fre和D57-70,在摇瓶培养条件下D57-74,Fre以及D57-70重组菌的发酵酶活分别比对照提高了12.9%、9.1%和8.1%。D57-74重组工程菌在5 L发酵罐最高酶活为31137 U/mL,比对照菌提升了15%。（3）组合策略提升TDL在毕赤酵母的表达:在最佳启动子和最佳信号肽的基础上,通过组合策略（基因多拷贝、分子伴侣共表达和高密度发酵条件优化）进一步提升重组TDL在毕赤酵母的表达量。首先研究了基因拷贝数对TDL表达的影响,在216个转化子中多拷贝重组菌X33-T23（拷贝数为3）发酵酶活最高,在摇瓶培养和5 L发酵罐条件下分别比单拷贝重组菌提升了47.4%和26.8%。其次以X33-T23为宿主,共表达单分子伴侣蛋白能够有效提升重组TDL的表达量,在12种分子伴侣蛋白中,PDI效果最好,其次为KAR2,HAC1和ERO1,这四种分子伴侣蛋白共表达重组菌在5 L发酵罐条件下的发酵酶活分别为57521U/mL,54280 U/mL,54234 U/mL和48156 U/mL。以重组菌X33-T23-PDI为宿主,再分别转入分子伴侣蛋白发现双分子伴侣蛋白共表达不能进一步提升重组TDL的表达量。最后优化了高密度发酵的诱导温度和pH,在最佳诱导条件下重组菌X33-T23-PDI在5 L、50 L和30立方发酵罐的最高酶活分别达到81203U/mL、81062 U/mL和56121 U/mL。（4）理性设计优化TDL温度特性:通过去糖基化提高了TDL在低温条件下的酶活性,突变体N55D的最适反应温度为50℃（比TDL降低了10℃）,N55D在30℃和40℃的相对酶活分别比TDL提升了28%和31%。通过增加二硫键和点突变提升了TDL在高温条件下的稳定性。首先通过引入二硫键提高TDL的热稳定性,二硫键突变体F12C/K237C和G66C/S121C在75℃水浴处理10分钟后,残留酶活分别是TDL的1.9倍和1.3倍。其次通过筛选获得点突变体42/45、98/100和103/104。在70℃水浴处理10分钟后,点突变体42/45、98/100和103/104残留酶活分别比TDL提高11%、13%和8%。最后通过组合二硫键突变体和点突变体进一步提升重组TDL的热稳定性,以二硫键突变体F12C/K237C为出发模板,通过组合突变获得7个热稳定性显著提升的组合突变体,其中组合突变体5效果最好。组合突变体5在75℃和80℃水浴处理20分钟后,残留酶活分别是TDL的6.9倍和4.6倍。（5）TDL及其温度突变体的应用研究:将TDL和N55D应用于造纸脱墨领域,TDL和N55D均能有效提升造纸脱墨效果,在30℃至50℃条件下,N55D的应用效果要好于TDL。将TDL和组合突变体5应用于肉鸡养殖领域,在玉米豆粕型饲料中添加TDL和组合突变体5均能提升肉鸡的日增重、粗脂肪消化利用率和养分表观利用率。相同添加量的情况下,组合突变体5的应用效果要好于TDL。本论文的研究结果为TDL的产业化应用奠定基础,此外也为脂肪酶的高效制备、温度理性设计以及在造纸脱墨和肉鸡养殖领域的应用提供技术参考。