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背景:血管功能完整是保证人体血液循环系统正常运转的首要条件,而内皮糖萼作为血管壁和血液间的保护性屏障,是维持血管功能正常化的关键因素,其结构或功能紊乱所致内皮功能损伤是诱发心血管疾病进程的始动因素。然而,内皮糖萼如何在复杂的血管病理生理微环境中维持自身动态平衡,尚未明确。研究发现动脉血管不同部位存在不同模式的流体剪切力,流体剪切力模式不同对内皮糖萼及内皮功能的调控机制也不尽相同。研究报道,振荡剪切力可诱导内皮细胞己糖胺生物合成途径紊乱;而己糖胺生物合成途径终产物尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）可通过O-连接-N-乙酰葡萄糖胺转移酶（OGT）介导蛋白发生O-连接β-N-乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc）翻译后修饰,并通过蛋白稳定性调控来参与下游靶蛋白生物功能调节。SIRT3是一种NAD+依赖性线粒体去乙酰化酶,主要通过其去乙酰化功能调控蛋白乙酰化水平,其积极参与血管各种不同病理生理过程的调节,而SIRT3的酶活性和蛋白稳定性受到蛋白质翻译后修饰的影响。积极探索SIRT3糖基化修饰在内皮糖萼中的作用可能为糖萼损伤机制的阐明和糖萼相关血管疾病的防治提供新视野。目的:基于振荡剪切力下己糖胺途径紊乱和SIRT3在维持血管功能中的重要作用,本研究旨在对O-GlcNAc糖基化SIRT3在内皮糖萼损伤中的调节作用及分子机制进行探讨。方法:1模型的建立和验证（1）通过小鼠颈动脉部分结扎联合脂多糖（LPS）刺激建立动物模型;利用数字化彩色超声诊断仪检测颈动脉血流速度及方向变化情况;采用免疫荧光染色检测血管内皮糖萼成分HS和糖蛋白变化;使用透射电镜（TEM）检测糖萼成分脱落情况;利用Western blot分析内皮糖萼成分硫酸乙酰肝素（HS）、多配体蛋白聚糖1（SDC1）和炎症指标血管细胞粘附分子1（VCAM1）、细胞间粘附分子1（ICAM1）改变。（2）通过低振荡剪切力联合LPS刺激建立细胞模型;利用免疫荧光染色检测细胞内皮特性;使用普通光学显微镜观察内皮细胞形态以及不同剪切力处理后细胞生长方向;采用免疫荧光染色检测糖萼中糖蛋白表达情况;利用Western blot分析内皮糖萼成分HS、SDC1表达水平。2利用Western blot检测LKB1-AMPK-p47phox通路以及糖萼降解酶Hyal2变化。3 SIRT3和O-GlcNAc糖基化在内皮糖萼损伤中的作用（1）采用Western blot分别检测小鼠颈动脉组织和主动脉组织中SIRT3、OGT蛋白水平表达变化;利用Western blot检测颈动脉组织中的总蛋白乙酰化水平和总的O-GlcNAc水平;通过生化分析仪检测小鼠血清中葡萄糖水平;（2）利用Western blot分析内皮细胞中SIRT3蛋白表达情况;采用WGA染色检测在OGA抑制剂PUGNAc干预后内皮细胞糖萼变化情况;（3）内皮细胞经干扰或过表达SIRT3和OGT后,利用WGA染色观察细胞糖萼变化情况。4 SIRT3的O-GlcNAc糖基化位点预测和验证（1）利用siRNA分别干扰OGT和SIRT3的表达后,免疫共沉淀分析SIRT3与OGT的相互作用;（2）序列比对分析8种不同种属的SIRT3保守序列区域,再利用Glycosylation Predictor系统分析人源SIRT3潜在的糖基化位点;（3）构建SIRT3点突变质粒,利用OGT过表达质粒或者OGA抑制剂PUGNAc处理293T细胞,免疫共沉淀验证SIRT3潜在糖基化位点;（4）利用SIRT3酶活性检测试剂盒定量分析SIR3糖基化位点对其酶活性的影响。5 O-GlcNAc糖基化SIRT3对内皮糖萼及细胞功能的影响（1）利用SIRT3点突变质粒转染内皮细胞,免疫荧光分析糖萼成HS、糖蛋白表达情况;通过Western blot分析糖萼成分HS、SDC1和糖萼降解酶Hyal2表达情况,以及LKB1/AMPK/p47phox信号通路的变化;（2）采用CCK-F试剂盒荧光检测内皮细胞在转染SIRT3点突变质粒后对单核细胞THP-1的粘附能力的影响。结果:1模型的建立和验证（1）小鼠颈动脉部分结扎后,数字化彩色超声诊断显示颈动脉血液流速降低,流动方向呈现出双向;小鼠颈动脉部分结扎联合LPS处理后,血管内皮糖萼脱落明显,糖萼成分HS、糖蛋白、SDC1表达下调,炎症因子VCAM1、ICAM1表达升高;（2）白光镜检和免疫荧光染色均表明实验所用内皮细胞具有内皮细胞特性,且在振荡剪切力处理后HUVEC生长方向混乱;细胞经振荡剪切力联合LPS处理后,内皮糖萼成分中糖蛋白、HS和SDC1表达降低。2动物模型和细胞模型均显示在振荡剪切力联合LPS处理组,LKB1和AMPK磷酸化水平降低,p47phox和Hyal2表达升高。3 SIRT3和O-GlcNAc糖基化在内皮糖萼损伤中的作用（1）小鼠在高浓度LPS单因素处理后,血清中葡萄糖水平降低;（2）小鼠在颈动脉部分结扎联合LPS处理后,颈动脉组织蛋白中蛋白SIRT3、OGT和O-GlcNAc水平均呈现出降低趋势,总的乙酰化水平升高;主动脉动脉弓部位的SIRT3和OGT蛋白表达也下调;（3）内皮细胞在震荡剪切力联合LPS处理后,SIRT3和OGT的蛋白水平均表达减少;且在OGA抑制剂干预后,损伤的糖萼有所恢复。（4）内皮细胞经SIRT3和OGT的siRNA的干预后,表面糖萼表达减少;再经SIRT3和OGT过表达质粒处理后可恢复糖萼的表达。4 SIRT3的O-GlcNAc糖基化位点预测和验证（1）免疫共沉淀表明SIRT3与OGT存在相互作用,且在分别干扰SIRT3和OGT的表达后,二者相互作用减弱;（2）序列比对分析不同种属来源SIRT3存在两个保守序列区域,且在人源SIRT3序列中存在6个潜在糖基化位点（150、152、159、320、321、329）,再次对SIRT3蛋白结构分析发现只有第159位点和329位点参与蛋白合成;（3）SIRT3点突变转染结果显示,第159位丝氨酸的突变对SIRT3与OGT的相互作用以及SIRT3的O-GlcNAc糖基化修饰、赖氨酸乙酰化修饰没有显著改变,而第329位丝氨酸突变减弱了SIRT3与OGT的相互作用,使SIRT3的O-GlcNAc糖基化修饰显著降低,赖氨酸乙酰化修饰明显增加;（4）酶活性结果分析表明在OGT过表达时SIRT3第329位丝氨酸突变显著降低SIRT3的酶活性。5 O-GlcNAc糖基化SIRT3对内皮糖萼及细胞功能的影响（1）内皮细胞在转染SIRT3点突变质粒后,内皮糖萼成分HS、糖蛋白、SDC1的表达均下调,降解酶Hyal2的表达升高,LKB1和AMPK的磷酸化水平降低;（2）内皮细胞转染SIRT3点突变质粒后,其与单核细胞THP-1的粘附增多。结论:1振荡剪切力联合LPS刺激内皮细胞导致内皮糖萼损伤;2 SIRT3和O-GlcNAc糖基化确定参与内皮糖萼损伤进程;3 OGT介导SIRT3在第329位丝氨酸发生O-GlcNAc糖基化,O-GlcNAc糖基化SIRT3提高酶活性;4 SIRT3 O-GlcNAc糖基化位点突变可通过LKB1-AMPK-p47phox轴下调内皮糖萼,增强内皮细胞与单核细胞粘附能力。