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牙菌斑微生物是牙周炎的始动因子,然而在菌斑普遍存在的情况下,只有约小于20%的人发展为重度牙周炎。牙周炎在不同的个体发生和发展的差异性,提示宿主因素在牙周炎发病机制中发挥重大作用。临床上也可以看到传统牙周治疗对部分牙周炎患者效果有限,在此基础上,学者们提出将宿主调节治疗(host modulatory therapies,HMT)作为传统牙周炎抗菌治疗的辅助治疗手段。宿主免疫炎症反应在对抗细菌感染时产生的蛋白酶(MMPs等)、致炎细胞因子(TNF-α, IL-1β等)以及前列腺素(PGE2)等炎症介质是导致牙周组织破坏的主体因素。HMT的目标是调节宿主免疫炎症反应,减少炎症介质对牙周组织的损伤。近期研究显示HMT作为牙周炎洁治和根面平整(scaling and root planning, SRP)的辅助治疗带来显著性的附加疗效。目前研究的宿主调节治疗药物主要包括三类：第一类是蛋白酶抑制剂(antiproteinases),此类药物通过抑制基质金属蛋白酶(MMPs)的产生及活性以减少牙周结缔组织的破坏。第二类是抗炎药物(anti-inflammatory drugs),此类药物通过抑制致炎细胞因子或炎症介质的产生以减少牙周组织的破坏。第三类是骨保护剂(bone-sparing drugs),此类药物通过抑制破骨细胞产生从而减少牙槽骨吸收。目前关于牙周炎宿主调节治疗的药物研究有很多,但大部分药物由于效果有限或者有明显副作用而未被批准使用于临床。葛根素(Puerarin, C21H20O9)是植物葛根中最主要的活性成分之一,属于异黄酮类。近年来的研究证实葛根素同时具有抑制MMPs、抗炎、骨保护等活性且具有较高的生物安全性,提示葛根素可能是牙周炎宿主调节治疗的有效药物。本课题通过丝线结扎诱导的大鼠牙周炎模型来观察葛根素作为宿主调节治疗药物是否能减轻牙周炎组织破坏,并从抗基质金属蛋白酶、抗炎以及骨保护三个方面探讨葛根素作为牙周炎宿主调节治疗药物的作用机理。第一部分葛根素作为宿主调节治疗药物对实验性大鼠牙周炎的疗效实验目的：利用丝线结扎诱导的大鼠牙周炎模型来评估葛根素是否能对牙周炎组织破坏起到保护作用。实验材料和方法：将40只雄性SD大鼠随机分为5组,每组8只：健康对照组(CON组)、丝线结扎组(L组)、葛根素100mg/kg (PR100),200mg/kg(PR200)、 400mg/kg (PR400)剂量组。灌胃法给予三个剂量的葛根素,每天一次；L组只接受药物溶剂(0.5%CMC)。采用丝线结扎法建立大鼠双侧下颌第一磨牙牙周炎模型,在建模第7天处死大鼠。取一侧下颌骨行micro-CT扫描,测量第一磨牙周围釉牙骨质界到牙槽嵴顶距离(CEJ-ABC)以及第一磨牙根间区骨体积(BV/TV)。取另一侧下颌骨脱钙制作切片,行HE染色测量骨吸收程度以及炎症细胞浸润数目；行天狼猩红染色进行胶原定量分析(A%)。实验结果：Micro-CT结果显示葛根素减少了牙槽骨吸收程度,PR200和PR400组的CEJ-ABC距离比L组显著降低；PR200组的骨体积(BV/TV)显著高于L组。在HE切片上进行的骨测量分析结果与micro-CT法一致,葛根素干预显著降低了第一磨牙远中牙间区CEJ-ABC距离以及第一磨牙根间区骨吸收面积；同时葛根素显著减少了牙周组织中炎症细胞数目。葛根素干预组(PR200)胶原纤维A%显著高于L组。结论：葛根素能够减少丝线结扎诱导的大鼠牙周炎的牙槽骨吸收、炎症浸润以及胶原破坏,可能成为牙周炎宿主调节治疗的候选药物。第二部分葛根素作为牙周炎宿主调节治疗药物的作用机制实验一葛根素抗基质金属蛋白酶的作用实验目的：EMMPRIN是MMPs的诱导因子,其糖基化程度影响MMP-2以及MMP-9的表达。本实验检测了葛根素对牙周炎组织中MMP-2和MMP-9的作用,并检测了此作用是否通过调节EMMPRIN糖基化实现。实验材制和方法：取第一部分实验中CON组、L组、PR200组中大鼠下颌第一磨牙牙齿周围龈缘下2mm的牙龈组织,提取蛋白,western blot检测组织中MMP-2和MMP-9的表达量,并检测EMMPRIN糖基化的变化。实验结果：与CON组相比,牙周炎L组的MMP-2与MMP-9表达量均显著增多；而葛根素显著性抑制了二者的增多。EMMPRIN出现在两个分子带区域,分别代表高糖基化形式(HG-EMMPRIN)和低糖基化形式(LG-EMMPRIN),EMMPRIN总表达量即(HG+LG)-EMMPRIN在三组间无显著性差异,而高低糖基化的比例即HG/LG-EMMPRIN在三组间分布不同,在L组高糖基化比例显著增高；与L组相比,葛根素显著性降低了此比例。结论：葛根素通过抑制牙龈组织中EMMPRIN糖基化而减少了MMP-2和MMP-9的产生,从而对牙周组织起到保护作用。实验二葛根素的抗炎作用实验目的:TNF-a与IL-1β是牙周炎病程中两个关键性的致炎细胞因子,受MAPK及NF-κB信号通路调控。本实验从体内和体外两方面检测葛根素对TNF-α与IL-1β的作用,评估葛根素是否能在牙周炎病程中发挥抗炎作用。实验材料和方法：在细胞实验中,对牙龈卟啉单胞菌LPS (Pg-LPS)刺激的RAW264.7巨噬细胞使用不同浓度的葛根素,realtime-PCR检测细胞中TNF-α以及IL-1β mRNA水平的变化；western blot检测MAPK及NF-κB信号通路的变化。最后在动物标本中验证葛根素对TNF-α与IL-1β的作用,western blot检测第—部分实验中CON组、L组、PR200组中大鼠牙龈组织中TNF-α、IL-1β的含量。实验结果：在细胞实验中,葛根素能浓度依赖性的抑制Pg-LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中TNF-α以及IL-1β mRNA的表达,并能显著抑制细胞中p38 MAPK, JNK MAPK的磷酸化以及NF-κB的活化。在动物实验中,葛根素能显著性减少丝线结扎诱导的大鼠牙周炎组织中TNF-α、IL-1β的表达。结论：葛根素能通过阻断p38 MAPK, JNKMAPK以及NF-κB信号通路来减少致炎细胞因子TNF-α以及IL-1β的表达,可能能在牙周炎病程中发挥较好的抗炎效应。实验三葛根素的骨保护作用实验目的：RANKL/OPG是调节破骨细胞分化以及骨吸收活性的关键分子。通过细胞实验和动物实验两个方面检测葛根素对RANKL/OPG的作用,探讨其在牙周炎中发挥骨保护作用的可能机制。实验材料和方法：在细胞实验中,用不同浓度葛根素(25μM,50μM,100μM,200μM)分别处理PDLCs 1天、2天、3天、4天,realtime-PCR检测细胞中RANKL以及OPG mRNA的变化。在动物实验中,对第一部分实验中CON组、L组、PR200组切片行免疫组化染色检测RANKL/OPG的变化,行TRAP染色检测破骨细胞的变化。实验结果：细胞实验中,葛根素处理1-4天不同时间组的PDLCs中均未检测到RANKL mRNA的表达。葛根素处理PDLCs一天后未对细胞中OPG mRNA产生显著影响；处理第2天和第3天呈浓度依赖性的增加细胞中OPG mRNA量；处理第4天四个浓度的葛根素均对细胞中OPG mRNA呈抑制作用。动物实验中,免疫组化结果显示葛根素对实验性牙周炎引起的RANKL和OPG表达增多均呈显著性抑制作用,但对RANKL的抑制程度更强,导致RANKL/OPG比值显著性降低。葛根素干预组(PR200)成熟破骨细胞数目比L组显著减少。结论：葛根素能调节牙周细胞和组织中RANKL和OPG的表达,减少破骨细胞生成,从而对牙槽骨起到保护作用。综上所述,我们通过丝线结扎诱导的大鼠牙周炎模型证实了葛根素作为宿主调节治疗药物能有效减少牙周炎引起的牙槽骨吸收和结缔组织破坏,这种宿主调节的作用机理来自抗MMPs活性、抗炎、骨保护三方面。葛根素能通过抑制牙周炎组织中EMMPRIN糖基化来减少MMP-2和MMP-9的产生；并能通过阻断MAPK和NF-κB信号通路减少致炎细胞因子TNF-α和IL-1β的产生；同时葛根素通过降低牙周炎组织中RANKL/OPG比例而减少破骨细胞生成。