【摘 要】
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第一部分LncRNA 00518在膀胱癌中的表达及对膀胱癌生物学功能的影响目的:探讨LncRNA00518（lnc00518）在膀胱癌（BCa）细胞系、BCa组织和癌旁组织中mRNA的表达水平;分析BCa组织中LINC00518的表达和临床病理因素之间的相关性,进一步分析LINC00518与BCa患者预后之间的关系。分析lnc00518表达水平对BCa生物学功能的影响。方法:首先我们下载TCGA数
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第一部分LncRNA 00518在膀胱癌中的表达及对膀胱癌生物学功能的影响目的:探讨LncRNA00518（lnc00518）在膀胱癌（BCa）细胞系、BCa组织和癌旁组织中mRNA的表达水平;分析BCa组织中LINC00518的表达和临床病理因素之间的相关性,进一步分析LINC00518与BCa患者预后之间的关系。分析lnc00518表达水平对BCa生物学功能的影响。方法:首先我们下载TCGA数据库中BCa和正常膀胱粘膜组织的RNA-seq数据,通过Edger函数对其进行差异分析,通过Survival函数对其进行预后分析。随后,我们选取72对BCa组织和配对的癌旁组织提取总RNA,应用qRT-PCR检测lnc00518的表达水平,统计并分析lnc00518表达水平与临床病理学指标和预后的相关性。采用小干扰和过表达质粒构建lnc00518低表达和过表达的EJ和T24 BCa细胞系,利用CCK-8实验、克隆形成实验及流式细胞术检测lnc00518低表达及过表达后对人BCa细胞增殖能力的影响;利用Transwell法检测lnc00518低表达及过表达后对人BCa细胞迁移、侵袭能力的影响。运用裸鼠皮下成瘤实验观察lnc00518对BCa发生发展的影响。结果:通过TCGA数据库分析发现lnc00518在BCa组织中表达量高于正常膀胱黏膜组织,生存分析显示lnc00518高表达与患者总生存时间呈负相关。随后72对BCa组织和配对的癌旁组织中验证的结果与TCGA分析结果一致,lnc00518在BCa中显著高表达。临床资料分析发现lnc00518的表达与患者肿瘤TNM分期、组织学分级呈正相关,同时lnc00518高表达患者总体生存率。CCK-8实验、克隆形成实验及流式细胞术发现过表达lnc00518,细胞周期G0/G1期比例降低,细胞增殖显著增强,细胞划痕试验和Transwell实验发现过表达lnc00518细胞迁移、侵袭能力显著增强;而敲低lnc00518,其细胞增殖、迁移、侵袭能力显著减弱。裸鼠成瘤实验显示敲低lnc00518后其成瘤能力明显降低。结论:BCa细胞及组织中lnc00518高表达,正常膀胱粘膜组织及癌旁组织低表达;并且lnc00518的表达和BCa的TNM分期、组织学分级和预后不良呈正相关。lnc00518能增强BCa的增殖、迁移侵袭及裸鼠皮下成瘤能力。提示lnc00518在BCa的演变进展过程中起着重要的作用。第二部分LncRNA 00518通过调控miR-101/EZH2促进膀胱癌发生发展的机制研究目的:寻找并验证lnc00518靶向调控的miRNA及下游通路,探索lnc00518促进BCa增殖的具体机制。方法:通过搜索在线的生物信息学数据库（RegRNA）,预测lnc00518可能的miRNA靶点,对可能的靶miRNA进行RNA水平验证,荧光素酶报告基因、RIP及回复实验进一步验证。结果:生物信息学数据库分析显示miR-24、miR-100、miR-101、miR-128及miR-204与lnc00518有潜在的结合位点。进一步验证分析发现敲低lnc00518后miR-101表达升高最明显,因此我们选择miR-101作为lnc00518的靶向miRNA。BCa组织和细胞的qRT-PCR结果显示lnc00518的表达与miR-101成负相关,荧光素酶报告基因和RIP的结果表明lnc00518可与miR-101直接结合,此外,生物信息学分析及荧光素酶报告基因结果表明EZH2是miR-101靶向调节的基因。CCK8实验显示抑制miR-101表达能够逆转lnc00518敲低导致的细胞增殖阻滞,Transwell迁移和侵袭实验同样显示下调miR-101能够恢复lnc00518敲低引起的细胞迁移和侵袭能力降低。另外,敲低lnc00518导致的EZH2表达下调可被抑制miR-101表达所逆转。结论:Lnc00518可通过海绵吸附miR-101发挥ceRNA功能从而上调其靶基因EZH2的表达,促进BCa的增殖、侵袭和迁移能力。
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