第一部分女性生殖道畸形患者的致病基因研究　　 背景:女性生殖道畸形是一类复杂疾病，主要包括输卵管、子宫、阴道及外阴的发育异常，同时还可能伴有卵巢、泌尿系统、骨骼、听力系统或其他器官的畸形。因该类较为复杂、罕见，近二十年来，国内外关于女性生殖道畸形的致病基因及其分子遗传机制的研究一直争议众多，目前尚无明确结论。　　 目前，女性生殖道畸形致病基因的研究方面涉及最多的为MRKH综合征(Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser Syndrome，先天性无子宫无阴道)患者的致病基因研究。国外相关动物实验已证实AMH基因，LHX1基因，WNT基因家族，HOXA基因家族等多个可疑基因在动物胚胎的苗勒氏管的分化、发育中起重要作用。而将上述热点基因在MRKH综合征患者中进行测序分析，发现除少数几例合并高雄激素血症的MRKH综合征患者有WNT4基因的突变外，均未发现其它基因的突变。基因突变筛查的失败促使研究者开始考虑MRKH综合征可能为染色体突变所致。近年来有研究者通过对MRKH综合征患者进行全基因组拷贝数变异(CNVs)分析，认为17q12片段的微缺失可能为MRKH综合征的病因。目前尚无关于中国MRKH综合征患者全基因组拷贝数变异的分析。　　 研究方法:　　 1、应用Affematrix SNP6.0芯片将在北京协和医院妇产科门诊收集的10例合并肾脏畸形和（或）椎体畸形的Ⅱ型MRKH综合征患者进行全基因组拷贝数变异分析。　　 2、在北京协和医院妇产科门诊收集一个三代近亲婚配家系，其后代有以泌尿生殖系统畸形为主的多发畸形患者。将该家系中的先证者（患者）应用AffematrixSNP6.0芯片进行全基因组拷贝数变异分析，并将先证者及其父母均利用全外显子组测序技术进行全基因组外显子测序分析。　　 3、分析全基因组外显子测序分析结果，将可疑变异位点应用PCR扩增、Sanger测序法首先在先证者中进行验证。同法将在先证者中验证的对所在基因编码的蛋白质的功能有破坏性影响的4个变异位点在其家系成员中进行表型共分离分析。　　 4、应用PCR扩增、限制性内切酶酶切、凝胶电泳分析法将上述4个变异位点在200例不合并生殖道畸形的中国汉族女性无关人群中进行验证，确定变异的罕见性。　　 5、分析上述4个变异位点所在基因编码的蛋白质的功能是否与女性生殖道发育过程相关。　　 研究结果:　　 1、10例Ⅱ型MRKH综合征患者全基因组拷贝数变异的分析未发现国外文献中所提及的拷贝数变异位点以及新的有意义的拷贝数变异位点。　　 2、近亲婚配家系中的先证者中未发现有意义的拷贝数变异位点。　　 3、先证者及其父母的全外显子组测序分析结果经Sanger验证后确定4个对所在基因编码的蛋白质的功能有破坏性影响的变异位点，具体为:ATG2A c.3313G＞A(P1105S),ZFPL1 c.749G＞A(S250N),MYEOVc.59G＞A(R20H)及HSD17B3c.749A＞G(p.Y299H)。　　 4、上述4个变异位点在家系成员中进行表型共分离分析，前三个变异位点在家系其他成员中均不存在。变异HSD17B3 c.749A＞G(p.Y299H)在患者父亲中亦存在，但因其父无子宫、阴道等女性生殖管道的发育，无法排除该突变在女性生殖道畸形中致病的可能性。　　 5、经验证，上述4个变异位点在200例正常女性人群中均不存在。　　 6、通过对ATG2A、ZFPL1、 MYEOV、 HSD17B34个基因所编码的蛋白质的功能分析，认为变异ATG2A c.3313G＞A(P1105S)，ZFPL1 c.749G＞A(S250N)作为女性生殖道畸形患者致病基因突变的可能性较大;而变异MYEOVc.59G＞A(R20H)，HSD17B3 c.749A＞G(p.Y299H)作为引起女性生殖道畸形患者致病基因突变的可能性较小。　　 小结:　　 1、对10例复杂型（Ⅱ型）MRKH综合征患者以及一个三代近亲结婚家系（先证者为以泌尿生殖系统畸形为主的多系统发育畸形的女性）进行了女性生殖道畸形患者相关致病基因的分析和研究。　　 2、利用先进的遗传技术—Affematrix SNP6.0芯片平台对MRKH综合征患者及近亲家系中的先证者进行全基因组拷贝数变异分析。　　 3、首次对中国MRKH综合征患者进行全基因组拷贝数变异分析，发现CNVs改变并非本研究中涉及的Ⅱ型MRKH综合征患者的病因，提示中国MRKH综合征患者的致病基因可能与国外患者不同。　　 4、研究利用先进的遗传技术—全外显子测序分析技术对近亲婚配家系中先证者及其父母进行全基因组外显子测序分析。　　 5、经全外显子组测序、突变验证及功能预测分析发现，变异ATG2A c.3313G＞A(P1105S)，ZFPL1 c.749G＞A(S250N)作为女性生殖道畸形患者致病基因突变的可能性较大。　　 6、下一步，我们将通过动物生物实验来验证ATG2A、ZFPL1基因在女性生殖道发育过程中的作用。　　 7、对女性生殖道畸形患者致病基因的研究和分析将对女性生殖道畸形患者的分子生物学机制、胚胎学研究、遗传学筛查和防治等提供新思路、新途径。　　 第二部分98例中国MRKH综合征患者的临床表型、家族史及性心理功能研究　　 研究背景:MRKH(Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser)综合征，国内通常称为“先天性无子宫无阴道”，具体表现为始基子宫以及阴道不发育，部分患者可合并子宫、阴道外其他系统发育的畸形。根据是否合并子宫、阴道外其它器官的畸形，可将MRKH综合征患者分为Ⅰ型（单发型）和Ⅱ型（复杂型）。随着近年来MRKH综合征研究的深入，其临床表型谱及畸形谱不断扩展，但目前国内尚无大量本量MRKH综合征患者临床表型的研究。因MRKH综合征患者多为散发患者，家族病例报道较少，且该病患者得到自己后代可能较小，目前MRKH综合征的遗传方式尚未明确，为进一步深入研究其遗传方式及致病基因，对MRKH综合征患者的亲属是否合并相关系统畸形的调查研究极有意义。关于MRKH综合征患者的治疗不仅应从解剖上满足其性生活的要求，更应改善其心理功能状态及性生活质量。虽然近年来关于不同治疗方式后MRKH综合症患者性生活情况的研究逐渐增多，但国内外关于MRKH综合征患者心理功能状态的研究较少。　　 研究方法:2012年3月至2013年3月期间本课题组在北京协和医院妇产科门诊共收集106例MRKH综合征患者。在签署知情同意的基础上，每例患者采集静脉血样6ml，建立MRKH综合征患者血样标本库。采集患者的一般信息及家族史资料并对患者进行体全面实验室辅助检查。患者在签署知情同意的基础上，回答本课题组设计的针对MRKH综合征患者的心理状态功能问卷。对调查近期内有性生活的患者通过回答性生活中的相关问题以及中文验证版女性性功能问卷评价其性功能。　　 研究结果:　　 1、在此期间，共有98例MRKH综合征患者符合研究标准（实验室辅助检查全面）。其中Ⅰ型MRKH综合征患者56例(57.1％)，Ⅱ型MRKH综合征患者42例(42.9％)。Ⅱ型患者中，34例(34.7％，34/98)患者合并不同类型的肾脏畸形，26例(26.5，26/98)患者合并不同类型的骨骼系统发育畸形，同时合并肾脏畸形及骨骼系统发育畸形的患者为18例(18.4％，18/98)。　　 2、对98例MRKH综合征患者家族史情况的调查发现，8例MRKH综合征患者的一级亲属有泌尿生殖系统、骨骼系统的发育畸形。并首次报道近亲婚配后代有MRKH综合征患者的家系一例，首次报道分别患MRKH综合征和重度先天性脊柱侧凸的孪生姐妹一例。　　 3、对98例中国MRKH综合征患者心理功能状态的调查发现，88.8％的患者初次得知此项诊断时会出现困惑、难以接受或不能接受的心理反应（即仅11.2％的患者能够接受）。而经心理调整适应后，68.4％的患者在接受调查时表示已接受该诊断。调查发现，60.2％的患者有自卑感，90.8％的患者担心别人知道自己患此病。对56例调查近期内有性生活的患者性伴侣的心理状态调查表明，41.1％(23/56)的性伴侣目前不知情。在56例患者的性伴侣中，57.1％(32/56)对生育后代要求迫切。　　 4、对56例患者术后情况的调查发现，生物补片法组患者较腹膜法组患者术后佩戴模具的时间缩短，术后开始性生活的时间明显提前。且生物补片法组患者术后自我评价提高及生活质量提高者明显多于顶压组。对56例患者术后性功能的调查发现，生物补片法组患者在性欲及性唤起方面均优于顶压组患者，但其它维度及FSFI总分在两组间均无差异。　　 结论:　　 本研究为国内首次对大样本量（98例）MRKH综合征患者进行的系统全面的调查研究。具体包括对患者的临床表型、家族史、心理功能状态及其中56例调查近期内有性生活患者的性功能调查。通过研究，得出以下结论:　　 1、98例MRKH综合征患者中，约1/3的患者合并肾脏发育畸形，近1/3的患者合并骨骼系统发育畸形。因此建议对MRKH综合征患者进行问诊时，应常规询问肾脏、骨骼系统病史。对所有MRKH综合征患者均应进行以下五项实验室辅助检查:(1)染色体核型分析;(2)盆腔超声检查;(3)肾脏超声检查，必要时MRI检查以排除肾脏发育畸形;(4)脊柱正侧位平片检查以排除椎体发育畸形;(5)女性性激素水平检查。　　 2、对MRKH综合征患者家族史的调查表明对于MRKH综合征患者的一级（或二级）亲属应筛查有无相关泌尿生殖系统及骨骼系统的发育畸形。　　 3、多数MRKH综合征患者均有自卑、怕别人知道的心理，而经过心理调整和适应，患者对该诊断的接受率明显高于首次得知该诊断时，这进一步提示医疗工作者心理咨询和治疗在MRKH综合征患者治疗中的重要性。　　 对患者性伴侣的心理状态调查发现，近半数性伴侣尚不知情，而超过半数的性伴侣有强烈的生育后代的需求。作为女性的一项重要社会功能，生育后代对两性关系影响重大。MRKH综合征患者如何与性伴侣进行沟通、如何维持和改善两性关系是临床工作者需要深入思考和探讨的问题。　　 4、生物补片法人工阴道成形术患者术后佩戴模具时间短、开始性生活时间早，且患者术后自我形体评价及生活质量评价较高。且在性功能评价方面，生物补片法阴道成形术患者与顶压法阴道成形术患者相比性欲、性唤起明显提高。生物补片法人工阴道成形术是值得推广的MRKH综合征患者的治疗方式。