【摘 要】
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井冈霉素是一类氨基环醇类抗生素,包含一个有效烯胺结构,在亚洲被广泛应用于水稻纹枯病的防治,同时也用于有效烯胺的化学合成,有效烯胺进而作为治疗二型糖尿病药物伏格列波糖的前体。井冈霉素的生物合成途径的阐明对于更加有效的利用这一化合物有重要的意义。在前期工作中,井冈霉素的生物合成基因簇已得到克隆并测序。测序的区域共45 kb,通过BLAST分析确定了27个开放阅读框。为确定此基因簇的正确性及完整性,我们
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井冈霉素是一类氨基环醇类抗生素,包含一个有效烯胺结构,在亚洲被广泛应用于水稻纹枯病的防治,同时也用于有效烯胺的化学合成,有效烯胺进而作为治疗二型糖尿病药物伏格列波糖的前体。井冈霉素的生物合成途径的阐明对于更加有效的利用这一化合物有重要的意义。在前期工作中,井冈霉素的生物合成基因簇已得到克隆并测序。测序的区域共45 kb,通过BLAST分析确定了27个开放阅读框。为确定此基因簇的正确性及完整性,我们将分别包含valABC和valKLMN的两个操纵子克隆到一个整合型载体pSET152上,并转入异源宿主变铅青链霉菌1326中。在整合了以上七个基因的变铅青链霉菌衍生菌株的发酵液中检测到了有效氧胺A。进一步将编码糖基转移酶的基因valG转入此衍生菌株中,发酵后检测到了井冈霉素A的产生。此结果说明valABCKLMN这七个基因能够满足有效氧胺A的合成,而ValG是负责最后一步将有效氧胺A糖基化合成井冈霉素A的糖基转移酶。在井冈霉素A的合成途径中,前期研究证实ValA是负责催化磷酸戊糖途径中的7-磷酸景天庚酮糖转化为2-表-5-表-有效醇酮的环化酶,是井冈霉素A合成途径中的第一步。而在本研究中通过体外酶活实验确认功能基因ValD是表异构化酶,负责催化2-表-5-表-有效醇酮异构化生成5-表-有效醇酮。当以7-磷酸景天庚酮糖为底物,ValA单独存在时,只生成2-表-5-表-有效醇酮;当ValA与ValD同时存在时生成5-表-有效醇酮。序列分析发现它属于VOC家族。类似于此家族的其它成员,ValD的每个活性位点分别由两个βαβββ模块构成;ValD的单聚体具有两个活性位点,且以二聚体的形式存在,因此它是VOC家族中目前发现的最大的成员。前期工作证实有效烯酮和有效酮是反应的中间产物,激酶ValC可以将这两个化合物磷酸化。但是其他中间产物没有被分离到或经过严格的体外酶活实验证实。氧化还原酶基因valN的缺失突变株发酵可产生1,1’-双-有效烯胺和有效烯霉素,分别比有效氧胺A和井冈霉素A多了一个双键,表明ValN负责催化井冈霉素A中C-5/C-6位的双键的还原,以有效烯酮或者7-磷酸有效烯酮为底物催化合成有效酮或者7-磷酸有效酮。唯一负责编码转氨酶的基因valM的缺失突变株发酵不能产生井冈霉素A或者有效氧胺A,表明它和井冈霉素合成相关,推测它负责井冈霉素A中氮原子的引入,以7-磷酸有效酮为底物催化合成7-磷酸有效胺。BLAST分析表明ValB是ADP转移酶,本研究中以化学合成的不同底物做酶活分析。结果表明ValB以ATP为核苷供体,负责催化1-磷酸有效烯醇生成ADP-有效烯醇,所以1-磷酸有效烯醇和ADP-有效烯醇都是合成途径中的中间产物。与ValB有60%同源性的来自阿卡波糖合成途径的NTP转移酶AcbR以ATP或者GTP作为核苷供体,也利用1-磷酸有效烯醇作为底物,生成ADP-有效烯醇或者GDP-有效烯醇。在糖基转移酶ValG的体外酶活实验中发现它除了UDP-葡萄糖之外,还可以利用非天然的糖基供体UDP-半乳糖催化合成新的化合物4"-表井冈霉素A,该化合物具有一定的抗真菌生物活性。本工作对井冈霉素生物合成途径有进一步的阐明,并通过遗传和生化手段得到了三种新的井冈霉素衍生化合物,对井冈霉素更广泛更有效的应用具有启发意义。
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