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目的探讨RNA干扰(RNA interference)介导表皮脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein-5, FABP-5)基因沉默的重组慢病毒载体(LV-shRNA-FABP5)对人肝癌细胞株HepG2的细胞增殖和基因表达、细胞周期和凋亡变化情况、细胞侵袭能力改变和裸鼠成瘤情况的影响。方法1.RT-PCR方法分别检测在人肝癌细胞系HepG2、SK-HEP-1和SMMC-7721细胞中FABP-5 mRNA的表达量,筛选目的细胞。2. RNA干扰技术设计合成3个特异性靶向FABP-5基因的shRN A重组慢病毒载体(]ABP5-shRNA表达载体),转染至人肝癌HepG2细胞,对不同靶点进行筛选。3.实验分为三组。FABP-5基因沉默重组慢病毒颗粒(LV-shRNA-FABP5)转染HepG2细胞作为实验组(Knock Down, KD);空载体重组慢病毒颗粒(LV-shRNA-NC)转染HepG2细胞作为阴性对照组(Negative Control, NC);空白对照组(Control)为正常条件下培养HepG2细胞。采用RT-PCR及免疫蛋白印记法检测FABP-5 mRNA及蛋白的表达。4. MTT法检测细胞增殖能力；Giemsa染色法观察各组细胞的克隆形成情况；细胞侵袭实验检测细胞体外侵袭能力；流式细胞术检测细胞周期变化和细胞凋亡情况。5.将实验组、阴性对照组及空白对照组的细胞分别接种于裸鼠右腋皮下0.5cm处,构建裸鼠肝癌移植瘤模型。连续4周观察裸鼠的成瘤情况、移植瘤大小及体积变化,绘制裸鼠移植瘤生长曲线。采用小动物活体成像仪观察裸鼠肝癌移植瘤的生长状况。4周后处死裸鼠,称量移植瘤的重量及计算瘤体体积。RT-PCR、Western blot和免疫组织化学法测定肿瘤组织中FABP-5基因的mRNA及蛋白的相对表达量。结果 1.RT-PCR结果提示FABP5在SMMC-7721中的表达丰度做敲减实验存在风险,在HepG2、SK-HEP-1中的表达丰度满足敲减实验要求。而HepG2细胞中表达丰度最高,筛选出人肝癌细胞HepG2作为目的细胞。2.成功构建了FABP5基因沉默的慢病毒载体。转染至人肝癌HepG2细胞中,观察得到转染效率均>90%以上。3. RT-PCR结果显示：三个实验组相对于空白对照组和阴性对照组,FABP-5 mRNA的表达量减少均>50%以上,其中LV-shRNA-FABP5(1)组(即1号靶点)FABP-5表达的敲减率最高,达85%以上(P<0.05)。Western blot结果发现相比于阴性对照组,LV-shRNA-FABP5(1)靶点的FABP-5蛋白表达减少88.28%(P<0.05),将此组作为实验组。4.MTT法结果得到.4490值分别在第1、2、3、4和5d时,空白对照组和阴性对照组均明显高于实验组(P<0.05)。Giemsa染色法检测发现实验组的克隆形成数(12±2)明显低于空白对照组(149±10)及阴性对照组(146±11),实验组细胞增殖能力明显受到抑制(P<0.05)。细胞侵袭实验得出,实验组细胞侵袭转移率(0.87%±0.11%)相比空白对照组(3.45%±0.12%)和阴性对照组(3.37%±0.06%),差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞技术检测结果：相比空白对照组和阴性对照组,实验组G1期比例降低,,S期和G2/M期比例增高(P均<0.05)。实验组中HepG2细胞凋亡率(26.88%±0.11%)明显高于阴性对照组(2.13%±0.36%),差异具有统计学意义(P<0.05)。5.裸鼠接种肝癌HepG2细胞后,三组裸鼠右腋下均有肉眼可见的肿瘤长出,成瘤率100%,结果显示实验组移植瘤的生长及成瘤能力明显减慢(P<0.05)。4周后测量空白对照组、阴性对照组、实验组的肿瘤组织平均体积分别为：(100.51±47.45)mm3、(104.02±52.89)mm3、(29.41±8.98)mm3(P<0.05)；空白对照组、阴性对照组、实验组的瘤体平均重量分别为：(0.632±203)g、(0.629±±0.226)g、(0.204±0.067)g,差异具有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR、Western blot结果发现FABP-5在实验组中mRN A和蛋白表达量低于空白对照组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学提示FABP-5蛋白表达情况基本和Western blot结果相符,在裸鼠肝癌移植瘤组织中表达FABP-5阳性信号定位于在细胞核和(或)细胞浆中表达,相比于空白对照组及阴性对照组,实验组FABP-5阳性表达率明显降低,差异有显著的统计学意义(P<0.05)。结论1. FABP-5基因的RNAi重组体可以有效抑制FABP-5基因的mRNA和蛋白的表达。2.人肝癌HepG2细胞中FABP-5基因沉默后细胞增殖受到抑制,癌细胞侵袭力降低,细胞凋亡明显增加,细胞周期阻滞于G2/M期。3. RNA干扰技术沉默HepG2细胞中FABP-5基因可以明显抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生长。4. FABP-5基因有可能成为肝癌基因治疗的新靶点。