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RNase L途径是由干扰素引起的一种抗病毒途径,RLI基因作为一种RNase L通路的负调节因子,被越来越多的研究。本研究以HaRLI基因作为研究对象,探究该基因在病毒处理以及植物介导的昆虫RNAi中的功能。具体的研究内容如下:1.HaRLI基因的克隆及序列分析采用同源搜索的方法,从棉铃虫转录组中得到BmRLI同源基因序列。利用RT-PCR方法在棉铃虫中克隆得到全长基因序列,命名为HaRLI。该基因包含一个1824bp的ORF,编码608个氨基酸。NCBI Blast显示其编码产物存在三个保守结构域,一个铁硫结合域和两个ATP结合盒。2.HaNPV病毒处理后HaRLI基因的表达情况利用RT-qPCR方法对正常饲养和病毒处理后虫子体内的HaRLI基因表达情况进行分析。结果表明:相对于正常饲养的虫子,HaNPV病毒处理24 h后HaRLI基因表达水平显著下降,达60%。3.转基因植株的获得及后代遗传分析HaRLI基因上存在一个BamH I位点,因此我们在两条引物的5′端分别设计Bsa I位点嵌套BamH I或者Sal I酶切位点,构建植物表达载体pBin438-HaRLI,农杆菌介导的方法将HaRLI基因导入到烟草基因组中。通过对Kan抗性平皿上种植的转基因T0和T1代植株种子进行遗传分析,结果发现:T0-4植株种子的Kan抗性符合孟德尔3:1分离比,推测第4株转基因植株为单一拷贝插入;该植株后代17株T1代植株的种子Kan抗性结果显示,5株为全抗型(纯和)、10株呈现大约3:1的分离比(杂合)、另外有2株分离比并不符合孟德尔的分离比,其抗性苗大约为敏感苗的4倍。4.叶片饲喂RNAi效率的影响构建了几丁质合酶1(Hachs1)、几丁质合酶2(Hachs2)和绿色荧光蛋白(GFP)基因的RNAi载体,并转化至HT115感受态中。用涂抹表达dsRNA菌液的野生型和T1-8植株叶片饲喂棉铃虫,RT-qPCR检测饲喂24 h的幼虫发现,野生型叶片饲喂后,Hachs2基因表达量出现下调,而Hachs1基因并没有被沉默,反而表达量有所升高;转基因叶片饲喂后,Hachs1和Hachs2基因表达量均下调,且相对于对照组,Hachs2基因下调幅度具有极显著的差异。对比发现,相对于喂食涂抹细菌dsRNA的野生型烟草叶片,Hachs1和Hachs2基因在喂食转基因叶片的棉铃虫中沉默效率更高。5.转HaRLI基因叶片抗虫性分析选取WT、T1-8和T1-20叶片进行棉铃虫的饲喂,12 h后叶片之间未观察到明显的区别,经36 h的喂食,虫子对WT叶片的咬噬情况相对较严重,但并没有明显的致死现象,说明转基因烟草对棉铃虫具有一定的抗性。以上研究为HaRLI基因的植物基因工程研究提供一些参考。