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副结核病(Paratuberculosis)是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)引起的反刍动物慢性消耗性疾病。该病主要在反刍动物中流行,以奶牛和黄牛最为易感,牛感染MAP后以持续性腹泻、进行性消瘦、肠黏膜增厚及形成皱襞为主要特征,因此又称副结核性肠炎。自1895年首次报道副结核病以来,已陆续在多个国家发现,目前已遍布全世界,我国于1975年发现该病。副结核病对养殖业的危害很大,尤其是奶牛和肉牛养殖行业,感染后奶牛的产奶量和肉牛的品质均受到不同程度的影响。MAP1068蛋白是一种保守性和种属差异性较高的蛋白,通过生物信息学预测,MAP1068蛋白属于一种半胱氨酸蛋白酶。在许多病原微生物中(如猪链球菌等)都有半胱氨酸蛋白酶的相关研究,半胱氨酸蛋白酶在病原微生物入侵宿主的过程中发挥了巨大作用,尤其是微生物在宿主体内定植和逃避宿主免疫方面。本研究通过构建重组质粒pET28a-MAP1068,在大肠杆菌中表达和纯化MAP1068蛋白,并以此蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠制备了多抗,筛选出了MAP1068蛋白发挥活性所需的最佳底物,证实了二价金属离子可以提高MAP1068蛋白的酶活性,并测定了发挥作用的最佳温度和最佳pH值。定点突变研究显示,C195、H238和D258氨基酸残基为MAP1068蛋白酶的活性催化中心,特别是D258对MAP1068的活性影响最大。为了研究MAP1068蛋白酶对小鼠的致病性,将pMV261穿梭载体转入耻垢分枝杆菌构建重组耻垢分枝杆菌pMV261/MS;map1068基因连接pMV261载体转入耻垢分枝杆菌,构建重组耻垢分枝杆菌MAP1068/MS;以重组质粒pMV261-MAP1068为模板,通过定点突变构建突变体重组菌D258A/MS。将三种重组菌(pMV261/MS,MAP1068/MS和D258A/MS)分别感染小鼠进行致病性研究。病理结果显示重组耻垢分枝杆菌MAP1068/MS和突变株D258A/MS均能对小鼠肝脏、脾脏、肺脏产生病理损伤。血清中细胞因子检测结果显示,重组耻垢分枝杆菌MAP1068/MS和突变株D258A/MS可以引起不同细胞因子的变化,从而导致不同程度的炎性反应。结果表明,MAP1068蛋白作为一种胞外蛋白酶具有蛋白酶的特性并且具有一定的致病性,通过定点突变后,其体外活性会部分丧失,但对小鼠的致病性无明显变化。本实验为副结核分枝杆菌致病机制的研究提供了新的思路,并为科学防控和治疗副结核病奠定了基础。