第一部分单中心Ph染色体阴性骨髓增殖性肿瘤患者临床特征分析[目的]自2008年世界卫生组织（World Health Organization,WHO）髓系肿瘤分类诊断标准制定以来,发现了大量与诊断、预后密切相关的细胞形态学、遗传学和分子生物学指标,有关诊断和预后的观点不断更新并最终影响到疾病治疗和管理。2016年,WHO针对包括骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasms,MPNs）在内的髓系肿瘤的诊断与分类标准进行了修订。本研究着眼于2016年WHO修订的最新分类标准对MPNs的更新要点,对本中心2009年～2017年诊断的2963例费城染色体阴性的经典型MPNs患者的初诊临床资料进行回顾性研究,分析新诊断标准应用下单中心MPNs疾病谱的变化和各亚型临床特征,以期早期正确分型、预后判断和治疗。[方法]收集本中心于2009年01月至2017年12月诊断的2963例MPNs患者诊断时的临床资料,采用最新的2016年WHO修订的分类标准对其进行重新分类,比较与2008年WHO标准分类结果的异同,分析根据新标准分类的不同亚型患者的初始临床特征。[结果]（1）纳入2963例MPNs患者,应用2008年WHO诊断标准分类,诊断出 PV 604 例（占 20%）,ET 2052 例（占 70%）和 PMF 212 例（占 7%）,还有 95例（占3%）JAK2突变阳性并具有PV组织学特征而不满足2008年WHO关于PV血红蛋白标准的患者被暂归类为隐匿性PV（masked PV,mPV）。应用2016年WHO修订的诊断标准重新分类后,PV的诊断范围进一步扩大,95例mPV全部诊断为PV;ET构成比变化最大,一部分原来的ET患者发生分型改变,其中56例被诊断为PV（之前被“掩盖”）,231例诊断为“纤维化前/早期”原发性骨髓纤维化（prePMF）。再分型后各亚型分布如下:ET患者1765例（占60%）,PV患者755例（占25%）,prePMF患者231例（占8%）,“明显纤维化期”原发性骨髓纤维化（overt PMF）患者212例（占7%）。（2）与显性PV（overt PV）相比,mPV以男性多见,表现为更低的Hb水平和更高的血小板计数（P＜0.001）;与JAK2V617F阳性的ET相比,mPV仍以男性占优势,具有更高的Hb水平和白细胞计数以及更低的血小板计数,并且脾肿大的发生率和诊断时合并骨髓轻度纤维化（1级）的比例更高,以上均具有统计学意义（P＜0.05）;从JAK2V617F阳性的ET、mPV到overt PV,Hb水平依次递增,血小板计数依次递减,形成连续体。三组在既往血栓事件发生率方面没有明显差异（P＞0.05）。（3）与2016年WHO标准诊断的ET（“真正的”ET）相比,从“旧的”ET中分离出的prePMF患者的血红蛋白水平、白细胞（WBC）计数和血小板（PLT）计数更高,有较高比例的患者出现WBC显著增高（WBC≥11 x109/L）和PLT极度增高（PLT≥1000x109/L）;具有更高的脾肿大发生率,染色体核型异常的比例和初诊时合并骨髓轻度纤维化（1级）的比例也更高（以上P＜0.001）;两组在性别、年龄及驱动基因突变方面没有明显差异（P＞0.05）。（4）与overt PMF相比,prePMF患者更年轻（中位年龄,57岁vs 61岁;P=0.024）,年龄＞65岁的患者比例较低,具有更高的Hb水平、白细胞计数和血小板计数,合并血细胞减少,脾肿大和具有体质性症状的患者比例以及染色体核型异常和具有复杂核型患者的比例明显为低（以上P＜0.001）;两组在性别和驱动基因突变谱方面没有明显差异（P＞0.05）;overt PMF组中高分子风险（high molecular risk,HMR）突变发生的频率高于prePMF组（P＜0.05）。（5）我们在4例所谓“三阴性”的ET患者中检测到了两种不典型的JAK2基因错义突变,3例为JAK2 M601I突变,1例为JAK2 S602N突变,患者均表现为孤立的血小板增多症并缺乏其它克隆性标记。[结论]（1）经2016年WHO分类标准再分型后,我中心MPNs的疾病谱发生了一定变化,对诊断和治疗模式可能产生重要影响。（2）Overt PV、mPV和JAK2V617F阳性的ET在临床特征上形成一个连续体,PV和JAK2V617F阳性的ET可能代表了JAK2突变的MPNs疾病谱的两个末端,而mPV则介于二者之间。（3）根据2016年WHO标准诊断的ET和prePMF具有不同的初始临床特征,是两个不同的疾病实体,区分二者具有重要的预后判断和治疗指导意义。（4）PrePMF和overt PMF在诊断时具有部分重叠的表型并具有连续性,二者在驱动基因分布方面没有明显差异,但overt PMF患者中高分子风险（HMR）突变发生的频率更高。（5）JAK2基因不典型突变可能是“三阴性”ET患者重要的分子病因,对“三阴性”的ET患者应进行包括JAK2基因所有编码区外显子的靶向测序并给予家系调查。第二部分利用全外显子组测序鉴定家族性骨髓增殖性肿瘤候选易感基因的研究[目的]骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasms,MPNs）主要由多能造血干细胞特征性的体细胞突变引起,其最常见的再现性突变发生在JAK2,CALR和cMPL基因。这些突变主要驱动疾病表型,并不是基础突变,长期以来一直推测存在某种先于驱动突变的胚系易感性,但迄今为止尚未完全明确。在家族性MPN中的全基因组关联研究（whole genome sequencing,GWAS）已经确定了一些增加克隆性MPN患病风险的胚系遗传变异,但也仅能解释一小部分的家族性MPN,因此MPN的家族遗传易感性仍需要进一步深入研究。本研究收集了 2个MPN家系,试图通过全外显子组测序（whole-exome sequencing,WES）及生物信息学分析方法,寻找与家族性MPN相关的遗传易感基因和胚系风险变异。[方法]对2个MPNs家系进行详细的家系调查,并绘制系谱图,分析遗传特征。采集患者血液和口腔粘膜成对样本,同时采集其未患病家系成员的血液样本,提取基因组DNA进行全外显子组测序。测序结果通过生物信息学分析、多重数据库过滤筛选,缩小候选基因范围,得到候选易感基因及突变位点列表。候选基因先在家系成员中通过Sanger测序进行“共分离”验证,然后再在家系外100个健康对照样本中进一步验证,最终锁定风险基因。同时我们在2个家系内通过Sanger测序检测2个已知的 MPN 风险易感 SNP:JAK2 rs10974944G 和 TERT rs2736100C。[结果]（1）2个家系中各有2名MPN患者,家系1为姐弟患病,分别为PMF和PV表型;家系2为母子患病,分别为PV和ET表型,4例患者均JAK2V617F突变阳性;系谱分析符合复杂疾病遗传模式。（2）通过全外显子组测序和生物信息学分析我们在2个家系中共筛选了 9个可能的候选变异体,其中仅有家系1中的GFI1:c.140C＞G:p.Ala47Gly 和家系 2 中的 BRIP1:c.2825G＞A:p.Cys942Tyr 分别满足家系内“共分离”条件且在家系外的健康对照中不存在。（3）4例患者均携带MPN风险相关的易感SNP:JAK2 rs10974944的杂和基因型（C/G基因型）,家系2的第二代患者携带TERT rs2736100C的杂合基因型（C/A基因型）,其发病年龄较亲代患者明显年轻。[结论]（1）家族性MPN符合复杂疾病遗传模式;（2）GFI1:c.140C＞G:p.Ala47Gly)和BRIP1:c.2825G＞A:p.Cys942Tyr可能为家族性MPN的胚系易感变异位点;推测家族性MPN中可能存在DNA修复基因突变导致的基因组不稳定。（3）携带 JAK2 rs10974944G 可能与 JAK2V617F 突变的获得有关;携带 TERT rs2736100C的患者发病年龄较早。（4）全外显子组测序是鉴定MPN相关遗传易感变异体和研究家族性MPN遗传易感机制的强有力工具。第三部分利用全外显子组测序寻找先天性红细胞增多症分子病因的研究[目的]遗传性红细胞增多症（hereditary erythrocytosis,HE）或先天性红细胞增多症（congenital erythrocytosis,CE）是一组罕见且异质的遗传性疾病,是由遗传因素引起红细胞生成失调导致的红细胞过度积累。目前,已发现与CE相关的基因有8个,但仅在30%～40%的CE患者中明确,仍有70%左右的CE患者分子病因诊断不明。二代测序技术的应用为鉴定CE患者的分子病因和发现CE相关的新的候选基因和变异体提供了手段。我们在临床工作中发现了一例先天性红细胞增多症的中国家系,采用全外显子组测序技术寻找其潜在的遗传学病因。[方法]（1）进行详细的系谱调查,绘制系谱图,分析遗传特征。（2）收集家系患者临床资料,总结家系患者的临床表型特征。（3）采集2例患者和1例未患病家系成员的血液样本,同时采集患者的口腔粘膜作为胚系来源的样本,提取基因组DNA进行全外显子组测序。应用生物信息学方法并结合遗传模式筛选可能的致病基因。（4）采用Sanger测序方法在家系成员中进行致病基因-疾病表型的“共分离”验证,进一步确定致病突变。[结果]（1）该家系跨越3代至少有4名男性患者和2名女性患者,外显率高,遗传特征符合常染色体显性遗传模式。（2）患者的主要临床特征为孤立的红细胞增多,无白细胞和血小板增多及脾肿大。骨髓红系单系增生,无原始细胞增生及纤维化。JAK2 V617F和JAK2外显子12突变均阴性。（3）外显子组测序鉴定到β-珠蛋白基因（HBB）的一个胚系杂合错义突变:HBB:c.328G＞A:p.V110M,为2例患者所共有而家系内未患病的正常对照血液样本中不存在,该突变与数据库中已报道的高氧亲和力血红蛋白Hb San Diego一致,可引起先天性红细胞增多症。通过Sanger测序在所有患者和另外3名无症状的家族成员中证实了相同的突变,确定Hb San Diego为该先天性红细胞增多症家系的致病突变。[结论]（1）我们报道了中国首例由高氧亲和力血红蛋白Hb San Diego引起的先天性红细胞增多症的家系。（2）临床工作中如发现红细胞增多症以显性方式遗传并伴有促红细胞生成素（EPO）水平正常或异常增高时,需考虑高氧亲和力Hb变体存在的可能,应给予系统的遗传学研究。（3）全外显子组测序技术提供了一种快速、准确鉴定先天性红细胞增多症致病突变的方法,可以直接应用于怀疑由遗传原因引起的红细胞增多症的分子病因诊断。