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人巨噬细胞移动抑制因子(Human macrophage migration inhibitory factor,hMIF)是一种重要的免疫调控细胞因子,组成性表达于全身多种组织,垂体前叶细胞、活化的T淋巴细胞、单核巨噬细胞等是其主要来源。hMIF基因编码区为348bp,编码由115个氨基酸组成分子量约为12.5KD的非糖基化蛋白。hMIF除细胞因子的基本功能外,还具有类似激素、生长因子、应激反应蛋白及糖基化抑制因子(GIF)等的多重作用,并可调节机体的免疫应答。已有的研究表明,MIF异常高表达是引起脓毒症、糖皮质激素拮抗、类风湿性关节炎、某些肿瘤的重要原因之一。以具有中和作用的MIF单克隆抗体治疗脓毒症小鼠,发现可显著提高其存活率,提示阻断MIF的作用可抑制MIF高表达所引起的相关病理过程。研究还揭示MIF在人鼠之间高度保守,其抗体制备困难;且抗体进入临床应用,人源化问题也是一大障碍。随着抗体库技术的出现,为人源抗体的制备提供了新的有效途径。本研究拟先制备具有生物学活性的重组hMIF再从大容量的全合成的人源性单链抗体库中筛选抗hMIF的单链抗体,并进行初步鉴定;为进一步获得一种具有潜在临床治疗前景的MIF特异性抗体抑制剂奠定基础。
主要研究内容和结果
1.功能性hMIF的制备与鉴定
1)构建了PET11b-hMIF,PET32a-Trx-MIF重组质粒,酶切测序正确后,转化BL21,IPTG诱导表达后,与预期的结果一致,SDS-PAGE显示PET11b-hMIF在12.5KD,而PET32a-Trx-MIF在30KD处出现了一条表达条带,两者的表达量约占菌体总蛋白30％,且为可溶性表达。
2)应用SP Sepharose FF阳离子交换层析和Hitrap26/60 sephacryl S-300分子筛纯化诱导表达的hMIF;应用His亲和层析柱纯化诱导表达的Trx-MIF。SDS-PAGE灰度扫描显示hMIF纯度为95％,Trx-MIF纯度为85％。Western Blot鉴定证明hMIF和Trx-MIF均能与特异性的MIF抗体结合。
3)用L-3,4-二羟基苯丙氨酸甲酯作为底物对hMIF,Trx-MIF互变异构酶的活性进行检测。hMIF具有明显的互变异构酶的活性(0.49±0.01),Trx-MIF(0.01±0.01)与无关阴性对照PreS1(0.02±0.02)无互变异构酶的活性,结果具有显著性差异(P＜0.01)。
4)通过hMIF,Trx-MIF刺激RAW264.7细胞释放NO,TNF-α,IL-6检测其细胞因子活性。结果显示hMIF在体外能剂量依赖性地刺激RAW264.7细胞释放NO和TNF-α,IL-6,而Trx-MIF不能刺激这些炎性细胞因子的释放。
5)盲肠结扎穿孔术(CLP)小鼠在术后12小时,分别腹腔注射5mg/kg重组hMIF和Trx-MIF,对比观察对生存率的影响。MIF组较CLP对照组生存率明显降低(p＜0.05),Trx-MIF组生存率与CLP对照组相比无明显变化。
2.人源性MIF单链抗体的筛选及初步鉴定
1)用纯化的有生物学活性的hMIF作为抗原对全合成人源性单链抗体库(库容为1.35×1010)进行了3轮筛选,3轮抗原包被的浓度依次为10μg/ml,5μg/ml,2.5μg/ml。
2)从第3轮筛选后的平板上,随机挑取共24个单菌落制备噬菌体抗体,经Phage-ELISA检测有9株与hMIF结合呈阳性,取其中4株强阳性的克隆(OD值＞2.0),通过噬菌体展示与hMIF,Trx-MIF,B型脑钠肽(Trx-BNP),降钙素基因相关肽(CGRP)进行结合特异性的检测。结果显示这4株均能与hMIF,TrxMIF特异性结合,而与无关Trx-BNP,CGRP无反应。
3)将这4株阳性克隆的单克隆细菌提取质粒,经SfiⅠ和NotⅠ双酶切,结果经1％凝胶电泳可见酶切产物大小约为750bp,与单链抗体的大小一致。用Vector NTI软件,以及NCBI的Igblast数据库,比对发现A2-1与B2-3共用一套框架系统,基因属于λ1H3家族;C14与M2H7共用一套框架系统,基因属于λ3H3家族。同时发现B2-1,C1-4,M2H7轻链CDR3区中出现了TAG琥珀终止密码子,由于我们的噬菌体展示载体上它能够20％通读为Q(CAG),若要进行其他系统表达,TAG琥珀终止子就要进行突变改造。利用重叠延伸PCR对B2-3,C1-4,M2H7三株scFv基因中的TAG终止子进行了突变,并把其基因克隆进原核表达载体PTIG-rrx,测序结果显示三株的TAG都成功突变为CAG。
4)选取序列中无终止子的A2-1噬粒,经SfiⅠ和NotⅠ双酶切,克隆进原核表达载体PTIG-Trx,选取阳性克隆转化BL21(DE3),用0.1mmol/L的IPTG进行37℃诱导表达6h,SDS-PAGE显示为包涵体表达,表达量约占细菌总蛋白的40％。
5)应用鼠抗His单抗,进一步进行Western blot检测,发现经IPTG诱导的PTIG-Trx-A2-1scFv在30kDa处显示出一条特异性条带。与预期的MIF scFv的分子量相符,空质粒载体PTIG-Trx的诱导全菌为阴性。表明感染菌经IPTG诱导后正确表达了MIF scFv。
6)应用His亲和纯化MIF(A2-1)scFv,收集5％,10％,100％洗脱液。分别进行SDS-PAGE电泳。10％沈脱液中含有较纯的MIF scFv,纯度可达95％左右。用ELISA分析纯化后的MIF(A2-1)的特异性,1∶1000稀释MIF(A2-1)scFv,hMIF吸光度值为(2.4±0.1),Trx-MIF吸光度值为(0.89±0.2)与无关蛋白组BNP吸光度值为(0.389±0.08),CGRP吸光度值为(0.272±0.05),具有显著性差异(P＜0.01)。
综上所述,本研究首先通过构建PET11b-MIF、PET32a-MIF表达载体,建立重组MIF纯化方案,通过体内、体外实验对不同表达方式的重组hMIF的互变异构酶活性、促进炎症因子释放,加重脓毒症动物死亡率的作用进行对比研究,从而获得了具有生物学活性的hMIF:进而利用hMIF从库容1.35×1010的全合成人源性单链抗体库,经过三轮亲和筛选,得到了4株与hMIF特异性结合的克隆,对其基因进行了酶切及测序鉴定,并对其中3株中的琥珀终止子成功进行了突变改造,并选择其中1株进行了原核表达、纯化,得到一株具有结合hMIF活性的scFv,为进一步获得具有中和活性的人源性抗MIF单链抗体奠定了重要的基础。