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目的:以乙醇孵育的大鼠原代肝细胞为研究模型,通过酶学与生化分析,系统观察槲皮素干预后乙醇代谢与铁应激状态下肝细胞氧化损伤相关指标及可变铁池(Lible iron pool,LIP-Fe)的变化,探讨槲皮素的潜在保护效应。方法:1、采用两步胶原酶灌流技术分离培养大鼠原代肝细胞,经不同剂量的外源性铁剂次氮基三醋酸铁胺(Fe-NTA,5~100μmol/L)处理24 h,检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)与谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)活性、细胞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)与谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平、活性氧(reactive oxygen species,ROS)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,以观察不同浓度Fe-NTA染毒后肝细胞氧化损伤程度变化,选择Fe-NTA适宜的染毒剂量。2、根据上述研究确定的Fe-NTA染毒剂量(50μmol/L)对乙醇(200 mmol/L)孵育的大鼠原代肝细胞联合染毒,观察同期槲皮素(100μmol/L)干预后上述氧化应激相关指标的变化,评价槲皮素对酒精与铁联合应激所致氧化损伤的保护作用。3、乙醇(200 mmol/L)孵育的肝细胞,经Fe-NTA(50μmol/L)、槲皮素(100μmol/L)单独或联合处理24 h后,通过钙黄绿素分光光度法测定细胞内LIP-Fe水平,比较槲皮素干预对乙醇与高铁联合染毒后肝细胞内LIP-Fe水平的影响。结果:1、与正常对照组相比,随着Fe-NTA剂量的增加,细胞内AST、LDH的释放逐渐增多,SOD活性逐渐下降,GSH耗竭加重及MDA水平上升,表现出剂量-效应关系。同酒精对照组相比,浓度低于50μmol/L的Fe-NTA与酒精共同作用时联合氧化毒性不明显。而浓度达到50μmol/L的Fe-NTA与乙醇共同孵育时,肝细胞AST与LDH释放急剧上升,GSH消耗严重及MDA水平升高,ROS生成急剧增多,表现出显著的联合毒作用。2、与正常对照组相比,乙醇、Fe-NTA(50μmol/L)的单独处理,均表现出AST与LDH的释放增多,GSH水平和SOD活性下降,MDA水平升高以及ROS生成明显增多。槲皮素处理后,与酒精对照组相比,LDH和AST释放明显减少,GSH水平和SOD活性均有上升,MDA水平下降及ROS生成减少。对乙醇和Fe-NTA联合处理的肝细胞进行槲皮素干预,与乙醇和Fe-NTA联合处理组相比LDH和AST释放明显下降,GSH水平和SOD活性升高,MDA水平下降及ROS生成显著减少。3、与正常对照组相比,乙醇和Fe-NTA染毒的肝细胞中LIP-Fe水平均有明显升高,而二者的联合作用下,LIP-Fe水平异常升高;槲皮素干预,较之正常对照组,LIP水平无明显变化;对乙醇和Fe-NTA联合处理的肝细胞进行槲皮素干预后细胞LIP-Fe水平明显降低。结论:铁染毒剂量的增加加剧肝细胞酒精性氧化损伤,表现出剂量-效应关系和氧化协同毒性。槲皮素干预有效抑制酒精和铁联合诱导的肝细胞氧化损伤和LIP-Fe水平升高。目的:大鼠原代肝细胞为研究对象,观察槲皮素干预对酒精孵育和铁负荷下肝细胞hepcidin、膜铁转运蛋白(ferroportin)、转铁蛋白受体(transferrin receptor 1, TfR1)及转铁蛋白受体2(transferrin receptor 2, TfR2)等铁代谢调控基因表达的影响,探讨槲皮素防治肝细胞酒精性铁过载的可能机制。方法:乙醇(200 mmol/L)和Fe-NTA(50μmol/L)联合孵育的大鼠原代肝细胞,经槲皮素(100μmol/L)处理24 h后,采用荧光实时定量PCR法(real-time PCR)测定肝细胞内hepcidin、ferroportin、TfR1及TfR2 mRNA表达变化,同时以乙醇(200 mmol/L)、Fe-NTA(50μmol/L)单独或联合处理肝细胞作为对照,观察槲皮素干预对铁代谢相关基因表达的影响。结果:1.与正常对照组相比:乙醇处理后大鼠原代肝细胞hepcidin和TfR2 mRNA表达下降,TfR1和ferroportin表达升高; Fe-NTA处理后肝细胞hepcidin表达明显升高,ferroportin表达变化不明显,TfR1和TfR2 mRNA表达有明显提高。2.乙醇(200 mmol/L)和Fe-NTA(50μmol/L)联合处理后,与正常对照组相比,hepcidin mRNA表达变化不明显,ferroportin与TfR1 mRNA表达明显升高,TfR2表达略有下降;与乙醇组相比,hepcidin和ferroportin mRNA表达均有明显提高,TfR2表达无明显变化;与Fe-NTA组相比,hepcidin表达明显下降,ferroportin表达水平显著升高,均具有显著性差异(P<0.01), TfR1略有升高,TfR2略有下降。3.槲皮素处理后,与正常对照组相比,肝细胞hepcidin表达略有下降,ferroportin表达轻微上升,均无显著性差异。TfR1表达升高,TfR2无明显变化。对乙醇和Fe-NTA联合处理的肝细胞进行槲皮素干预,与联合处理组相比,hepcidin mRNA表达无明显变化,而ferroportin和TfR2表达明显升高,TfR1表达略有下降。结论:酒精染毒抑制肝细胞hepcidin的表达而高铁应激可诱导hepcidin高表达。同时hepcidin与ferroportin mRNA表达呈反向变化。槲皮素干预对酒精和铁联合应激下肝细胞铁调控基因表达起到潜在调节作用。