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血管钙化以往指羟基磷灰石沉积在血管壁的过程,但是最近许多证据显示其是一个类似于骨形成的高度调控过程。血管钙化与心血管疾病的发生发展息息相关,其普遍存在于动脉粥样硬化和高血压等疾病中,但目前尚无有效的手段预防和治疗血管钙化,因此探索血管钙化的发生机制对预防和治疗血管钙化显得极其重要。过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(peroxisome proliferators activated receptor γ,PPARy)是一种核受体转录因子,受配体的激活发挥转录调控作用。已有研究表明PPARγγ在心血管系统中起着非常重要的作用,但其在转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1,TGFβ1)诱导的血管钙化中是否扮演着重要角色还未可知。关于血管钙化的发生机制有很多观点,但自噬在血管钙化的调控过程中是否发挥着重要的作用尚不清楚,因此本课题在TGFβ1诱导大鼠主动脉血管平滑肌细胞钙化的基础上,探讨PPARγγ激动剂罗格列酮能否抑制血管平滑肌细胞钙化以及是否与自噬相关,旨在为血管钙化的预防和治疗提供新的靶点。本课题共分为三部分第一部分:TGFβ1对血管平滑肌细胞钙化的作用目的:研究TGFβ1对血管平滑肌细胞增殖和钙化的作用。方法:运用CCK-8法检测TGFβ1对血管平滑肌细胞增殖的影响。通过茜素红S染色、钙含量和ALP活性检测TGFβ1对血管平滑肌细胞钙化的影响。Western Blot方法检测钙化相关蛋白(Runx2)的表达情况。结果:CCK-8实验发现4ng/ml TGFβ1可显著促进血管平滑肌细胞增殖。茜素红S染色、钙含量和ALP活性检测结果显示随着TGFβ1作用时间延长和浓度不断升高,VSMCs钙化越明显,并且在TGFβ1浓度为4ng/ml时,钙化最明显。Western Blot结果也显示TGFβ1能够上调钙化蛋白Runx2的表达。结论:一定浓度范围内TGFβ1可促进血管平滑肌细胞增殖,TGFβ1可诱导血管平滑肌细胞发生钙化。第二部分:罗格列酮对TGFβ1诱导血管平滑肌细胞钙化的影响目的:研究不同浓度罗格列酮对TGFβ1诱导血管平滑肌细胞钙化后的作用。方法:不同浓度罗格列酮作用于血管平滑肌细胞后进行茜素红S染色、钙含量和ALP活性检测血管平滑肌细胞的钙化情况,同时Western Blot检测相关蛋白(α-SMA、Runx2、PPARγ)表达情况。结果:不同浓度罗格列酮作用于血管平滑肌细胞后,茜素红S染色、钙含量和ALP活性检测结果显示VSMCs钙化有所减轻,且在罗格列酮浓度为20umol/L时作用最明显。Western Blot结果显示罗格列酮能够下调Runx2蛋白的表达和上调α-SMA、PPARy蛋白的表达。结论:一定浓度罗格列酮可以减轻TGFβ1诱导的血管平滑肌细胞钙化。第三部分:罗格列酮抑制血管平滑肌细胞钙化机制的初步研究目的:探讨罗格列酮对血管平滑肌细胞钙化影响的初步作用机制。方法:自噬抑制剂3-MA作用于血管平滑肌细胞后进行茜素红S染色,钙含量和ALP活性检测血管平滑肌细胞钙化情况,同时Western Blot检测相关蛋白(Runx2、α-SMA、PPARy、Beclin1)的表达情况,RT-PCR 检测相关 mRNA(Runx2、α-SMA、Beclin1)的表达情况。结果:茜素红S染色结果发现加入自噬抑制剂3-MA后形成明显的钙化结节,同样钙含量和ALP活性检测结果显示,自噬抑制剂3-MA干预后血管平滑肌细胞钙含量显著增加。Western Blot和RT-PCR结果表明3-MA能够增加Runx2蛋白和mRNA的表达,同时抑制α-SMA、PPARy、Beclin1蛋白和mRNA的表达。结论:罗格列酮抑制血管平滑肌细胞钙化的作用可能与自噬相关。