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研究背景心脏作为机体中重要的高耗能器官,每日需要消耗大量能量维持其正常的舒缩活动。正常心脏代谢活动所需能量的60%-90%来源于脂肪酸,剩余10%-40%则主要由碳水化合物(葡萄糖、乳酸和酮体)氧化供能。在不同的生理或病理情况下,心脏能量代谢会发生一系列的改变来满足心肌的需要。心肌能量代谢转换是心肌在各种应激刺激下的一种反应。缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)病理损伤后心肌能量代谢会发生一系列变化:缺血期因为氧气供应不足,葡萄糖氧化和脂肪酸氧化均明显下降,此时心肌主要依靠糖酵解为其供能,再灌注期冠状动脉恢复血供后,心肌细胞氧气供应很快恢复,脂肪酸氧化水平迅速升高,此时糖酵解仍然处在一个比较高的水平,升高的脂肪酸氧化和糖酵解会抑制葡萄糖的氧化,使葡萄糖氧化降低,这些能量代谢的改变和心脏功能紊乱有关。丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase 4,PDK4)是葡萄糖氧化过程中的关键酶,可以使丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase,PDH)发生磷酸化而失活,抑制丙酮酸进入线粒体发生氧化脱羧反应,从而抑制葡萄糖氧化。抑制PDK4可促进葡萄糖的有氧氧化进程。我们课题组研究发现,胰岛素不仅可以调节心肌能量代谢,还可通过激活PI3K-Akt“生存信号”通路发挥心肌保护作用。胰岛素通过抑制骨骼肌PDK4影响葡萄糖的有氧氧化;肥胖及2型糖尿病患者,PDK4活性升高导致机体胰岛素抵抗,而直接或间接刺激葡萄糖氧化可以改善再灌注心脏功能。缺血/再灌注心肌葡萄糖氧化水平降低,而葡萄糖的摄取是如何变化的以及其中的变化机制目前尚不清楚。研究目的1.明确缺血/再灌注病理过程心肌葡萄糖摄取变化情况。2.探讨葡萄糖摄取的改变机制及其在心肌缺血/再灌注损伤中的意义,为缺血/再灌注心肌保护提供新的靶点或者策略。实验方法成年雄性SD大鼠,开胸行冠状动脉左前降支结扎术,制备心肌缺血/再灌注模型。采用小动物PET/CT和2-NBDG荧光探针测定心肌对葡萄糖的摄取;采用TTC-Evansblue双染色法检测心肌梗死面积。RT-PCR检测心肌糖酵解相关蛋白(激)酶的基因水平;Western-blot检测PDK4和胰岛素信号通路关键分子的表达水平。提取心肌线粒体检测线粒体耗氧和呼吸控制率;采用ELISA方法检测心肌乳酸含量和血清胰岛素水平。分离和培养乳鼠心肌细胞,制备细胞缺氧/复氧(hypoxia reoxygenation,H/R)模型,通过腺病毒和小干扰RNA(siRNA)改变目的基因的表达,观察PDK4与心肌胰岛素敏感性之间的关系。实验结果1.缺血/再灌注心肌对葡萄糖的摄取下降。采用PET/CT和荧光探针2-NBDG检测缺血/再灌注心肌葡萄糖的摄取,缺血/再灌注心肌对FDG的摄取下降约60%,对2-NBDG的摄取下降约50%,提示缺血/再灌注心肌对葡萄糖的摄取下降。葡萄糖转运进入细胞主要依赖葡萄糖转运体(glucose transports,GLUTs),接下来我们检测了缺血/再灌注心肌GLUT1和GLUT4的水平。发现缺血/再灌注缺血区心肌GLUT1表达显著上调,而GLUT4水平及其膜上转位并未发生明显改变。提示缺血/再灌注心肌葡萄糖的摄取减少并不是因为葡萄糖转运体变化的结果。2.缺血/再灌注心肌葡萄糖氧化水平降低,糖酵解增加。缺血/再灌注缺血区心肌较非缺血区心肌乳酸含量明显上升,糖酵解相关(激)酶的基因(hexokinase2,muscle Phosphofructokinase,aldolase,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,PDK4)表达均增加。分离线粒体后检测线粒体的氧耗,发现缺血区心肌Ⅲ态呼吸的耗氧水平下降,呼吸控制率(Ⅲ态呼吸/Ⅳ态呼吸)明显下降。提示缺血/再灌注心肌葡萄糖氧化和糖酵解脱偶联,葡萄糖氧化能力下降,糖酵解水平上升。3.抑制PDK4增加缺血/再灌注心肌葡萄糖氧化,并提高葡萄糖摄取。作为葡萄糖氧化过程中的关键酶,缺血/再灌注心肌PDK4水平明显升高。抑制PDK4后乳酸含量明显减少,Ⅲ态呼吸的耗氧增加,呼吸控制率增加,2-NBDG的摄取增加。心肌细胞腺病毒过表达PDK4后2-NBDG的摄取降低,siRNA沉默PDK4后2-NBDG的摄取增加。表明抑制PDK4增加缺血/再灌注心肌葡萄糖氧化,并促进葡萄糖摄取。4.增加葡萄糖的摄取可保护缺血/再灌注心肌。缺血/再灌注心肌血清中LDH水平升高,左室收缩压(LVSP)和左室内压最大变化速率(±LVdP/dtmax)均下降。抑制PDK4后再灌注心肌梗死面积减小,血清中LDH水平下降,LVSP和±LVdP/dtmax上升,葡萄糖处理后心肌梗死面积减小,血清中LDH水平下降,LVSP和±LVdP/dtmax上升。提示增加葡萄糖摄取具有缺血/再灌注心肌保护作用。5.抑制PDK4提高缺血/再灌注心肌胰岛素敏感性。抑制PDK4后缺血/再灌注大鼠血糖和血清中胰岛素水平未发生明显变化,但心肌细胞膜上GLUT4转位增加,Akt磷酸化水平升高。腺病毒过表达心肌PDK4后给予缺氧/复氧处理降低了心肌细胞胰岛素敏感性,siRNA沉默PDK4后给予缺氧/复氧处理可提高心肌细胞胰岛素敏感性,以上结果提示抑制PDK4可提高缺血/再灌注心肌胰岛素敏感性,增加再灌注心肌葡萄糖摄取,减轻心肌损伤。结论1.大鼠缺血/再灌注心肌对葡萄糖的摄取降低。2.抑制PDK4增加葡萄糖摄取可减轻缺血/再灌注心肌损伤,改善心脏功能。该结果提示PDK4可以作为提高心肌葡萄糖摄取和保护缺血/再灌注心肌的靶点。