目的:甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤,根据甲状腺癌分化程度可分为:分化型甲状腺癌、低分化型甲状腺癌和未分化型甲状腺癌（甲状腺未分化癌,anaplastic thyroid cancer,ATC）。ATC是人类恶性程度最高的实体肿瘤之一,总体中位生存期为4-6个月。传统的手术、放疗及化疗等治疗手段均不能改善ATC预后。因此深入研究ATC发生发展的分子机制,探寻更多ATC关键促癌因子并针对性地开发精准靶向治疗药物,控制其恶性生物学行为,改善预后,提高ATC患者生存率有重要临床意义。随着分子生物学技术的发展和对ATC发病机制的进一步认识,针对ATC的靶向治疗成为该疾病的研究热点。Hippo-YAP通路异常与肿瘤的发生发展密切相关,Hippo-YAP通路有潜能成为肿瘤治疗的药物靶点。但YAP作为转录调控蛋白,缺乏与药物结合的特征,难以用小分子化合物直接靶向干预。因此,积极寻找Hippo-YAP上游调控靶点是未来针对Hippo-YAP通路抗肿瘤药物发展的一个重要方向。去泛素化酶通过识别特异性底物,进而调控关键蛋白的去泛素化过程,存在明显的催化位点且活性口袋明确,小分子抑制剂容易与其结合并调控其功能,通过干预特异性的去泛素化酶可大幅减少脱靶效应带来的安全性问题,是非常理想的药物作用靶点。寻找针对ATC有效的、作用于HippoYAP上游的去泛素化酶,有望成为ATC治疗的潜在靶点。本课题将筛选研究调控YAP蛋白的去泛素化酶,明确其调控YAP的具体分子机制,从而为ATC的治疗提供新靶点。材料和方法:1.通过CCK8增殖实验、Edu实验、克隆形成实验对细胞的生长速度进行检测。2.通过流式细胞术检测细胞周期。3.通过划痕实验检测细胞的迁移能力。4.通过transwell实验检测细胞的侵袭能力。5.通过动物模型检测移植瘤生长速度。6.采用Western Blot检测YAP蛋白,筛选去泛素化酶文库中调控YAP表达水平的潜在去泛素化酶。7.通过荧光定量PCR检测UCHL3对YAP及其下游靶基因的m RNA的影响。8.通过荧光素酶报告基因实验检测UCHL3对YAP转录活性的影响。9.利用底物半衰期实验、蛋白酶体降解途径、去泛素化实验,分析UCHL3对YAP的去泛素化修饰方式,包括K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63位点的修饰。10.构建UCHL3和YAP不同结构域的截短子,利用免疫共沉淀技术明确UCHL3和YAP相互结合的具体结构域。11.利用Real-time PCR、Western Blot技术检测YAP/TEAD4诱导UCHL3的表达情况。12.通过报告基因分析YAP/TEAD4过表达对UCHL3启动子转录调控的作用。13.利用CHIP实验检验YAP/TEAD4结合UCHL3启动子区域的具体DNA片段。14.通过临床样本和免疫组化实验,分析UCHL3、YAP的蛋白表达量及共表达关系。结果:1.在甲状腺未分化癌细胞中沉默YAP的表达,细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著降低。2.通过去泛素化酶文库筛选发现,在98个去泛素化酶中,敲低UCHL3可以显著降低YAP蛋白表达水平,而对YAP的m RNA无影响。敲低UCHL3可以下调YAP的转录活性,抑制其下游靶基因（CTGF、CYR61、ANKRD1）表达。3.底物半衰期实验和MG132实验证实UCHL3通过蛋白酶体途径调控YAP蛋白的稳定性。4.体内和体外去泛素化实验证实UCHL3可直接裂解YAP蛋白上的泛素链,从而抑制YAP蛋白水解。5.免疫共沉淀实验表明UCHL3的羧基端与YAP的WW结构域直接结合。6.YAP/TEAD4通过直接结合UCHL3基因的启动子区域,调控UCHL3的转录水平。7.细胞实验和动物实验证实UCHL3通过YAP调控肿瘤的增殖和转移,敲低UCHL3时,细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著降低,体内移植瘤生长速度减慢。而过表达YAP可逆转UCHL3沉默引起的抑制效果。8.临床样本的免疫组化结果表明,UCHL3和YAP在甲状腺未分化癌中高表达,且两者表达正相关。结论:综上,YAP蛋白在甲状腺未分化癌中发挥着重要的促癌作用。通过去泛素化酶文库筛选在甲状腺未分化癌中调控YAP的去泛素化酶,发现UCHL3可通过去泛素化调控YAP的表达。研究表明YAP/TEAD4可转录促进UCHL3的表达,从而形成正反馈环路。抑制UCHL3可抑制甲状腺未分化癌的进展,而过表达YAP可逆转UCHL3沉默引起的甲状腺未分化癌抑制效果。组织芯片结果表明UCHL3和YAP在甲状腺未分化癌中高表达,且存在共表达关系。本研究在甲状腺未分化癌中发现调控YAP表达的新去泛素化酶UCHL3,揭示其通过YAP途径促进甲状腺未分化癌的进展,为甲状腺未分化癌治疗提供新的靶点。