研究背景和研究目的大肠癌(CRC,包括直肠癌和结肠癌)是人类常见的恶性肿瘤之一,严重影响着结直肠患者的生存质量。据统计资料显示,在西方国家其发病率居恶性肿瘤的第2位,在国内随着生活水平的不断提高以及饮食习惯的改变,国内其发病率日渐增高。专家预测结直肠癌的发病率与死亡率在我国今后很长一段时期内将稳步上升,成为我国最常见的、发病率上升最快的恶性肿瘤之一。然而,早期结直肠癌缺乏特异性的临床表现且缺乏高灵敏度和强特异性的早期诊断技术,大部分患者确诊时已是中晚期,失去了最佳治疗时机,因此研究结直肠癌无损快速诊断方法,对早期发现结直肠癌,对结直肠癌患者进行早期诊断与治疗,提高患者的生活质量具有重大的意义。肿瘤M2型丙酮酸激酶(Tumor M2-pyruvate kinase,PKM2)是近年来发现的一种新型肿瘤标志物,它是丙酮酸激酶家族中一种同工酶,在多种恶性肿瘤的中有表达。PKM2主要分布于肠、肺、胚胎以及增殖或未分化的组织中。研究发现PKM2在结直肠癌患者血液、体液或粪便中也能检测到,PKM2在肿瘤组织的坏死、转化、增殖过程中能由细胞分泌并释放至血液及其他体液。肿瘤细胞由于黏附性降低而更新较快,脱落的肿瘤细胞随粪便排出体外,为结直肠癌粪便PKM2的检测提供了来源。应用Elisa方法检测结直肠癌粪便中的PKM2,结果显示结肠癌患者的粪便标本中PKM2值比正常人高出许多,所以,粪便中PKM2的检测为结肠癌筛查提供了一种很有前景的新手段。糖链抗原 19-9(carbohydrate antigen 19-9,CA19-9)是 1979 年Koprowski等用结肠癌细胞免疫小鼠,并与骨髓瘤杂交所得116NS199单克隆抗体。它为唾液酸化的乳-N-岩藻戊糖Ⅱ,是一种类粘蛋白的糖蛋白成分。分子量为3.6万Dalton。在碱性条件下37℃、5h抗原性不改变。其可被McAb识别,但是有些稀有血型患者(约3～7%)不能表达CA19-9。胚胎期分别于胎儿的胰腺、肝胆和肠等组织;在成人的胰、胆等部位也有少量存在。CA19-9是一种与胰腺癌、胆癌、结肠癌和胃癌相关的肿瘤标志物,又称胃肠癌相关抗原,在多种腺癌中均升高。CA19-9在临床上的应用较广,已成为结直肠癌早期诊断的血液指标,但在血液中的单独检测其灵敏度及特异性的效果不理想。因此常与其他标志物联检,以提高诊断敏感性。大便潜血试验(fecal occult blood test,FOBT)是结直肠癌临床检验和普查最常使用的方法,普通FOBT能够很灵敏的检测到结直肠癌以外的消化道少量的出血,因此大大降低了筛检结直肠癌的特异性。但免疫学化学法FOBT利用抗原抗体的特异性结合的原理,由于人血红蛋白的珠蛋白通过上消化道时已被降解、代谢而失去免疫原性,通过使用抗人血红蛋白抗体检测粪便中未受破坏的珠蛋白成分或其他血液成分。对结直肠癌粪便的检测率有所提高,因此免疫化学法检测粪便潜血对于结肠和直肠癌出血更具特异性,而且免疫化学FOBT不会与非人类血红蛋白反应,不必限制膳食,受上消化道出血的影响也最小,可显著提高对结直肠癌检测的特异性和患者的依从性。本课题组采用胶体金免疫层析技术检测粪便脱落细胞的标志物。胶体金免疫层析技术(Gold immunochromatography assay,GICA)是一种很有前景的快速免疫检测技术,它将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起形成的固相标记免疫检测技术。由于金标抗体具有稳定性好、容易保存、灵敏性高的特点,并且不容易受样本中的酶和其它因素的干扰,使胶体金免疫层析技术这种分析技术可用于多种临床本的检测,并且该技术具有操作简单快速,无须特殊仪器等优点,适合于各级医疗单位使用,亦可用于家庭成员的诊断、保健、体检等方面。本课题研究对该技术进一步革新,将原先只能检测一种标志物发展为能同时检测多种标志物的多元金标免疫层析技术,即用一条试纸同时检测多种有联检意义的标志物的多元检测,该技术的改进对有联检意义的多个指标的检测有很大的应用价值,可大大提高检测效率和结果的可靠性。研究方法1、结直肠癌脱落细胞相关标志物PKM2在结直肠癌组织和细胞中的表达和鉴定提取8株结直肠癌细胞株蛋白以及10对结直肠癌组织及正常肠粘膜组织蛋白,采用Western bloting检测PKM2在8株结直肠癌细胞株及10例新鲜配对结直肠癌组织和正常粘膜组织中的表达情况;采用细胞免疫化学及免疫荧光分析结直肠癌细胞株的定位;采用免疫组化方法检测石蜡包埋配对结直肠癌组织及相对正常粘膜组中PKM2的表达情况,并分析PKM2表达与结直肠癌的相关性。2、胶体金-抗体复合物的合成以胶体金作为示踪标志物和层析试纸条的侧向泳动,结合免疫学标记技术,建立PKM2、CA19-9以及FOBT结直肠癌快速筛查试纸条的研制。首先我们采用1%柠檬酸三钠还原法制备五种直径大小不同的胶体金颗粒,即直径为10nm、15nm、20nm、30nm及40nm的胶体金,利用紫外线可见光分光光度仪对上述胶体金从400nm-700nm进行扫描,获得最大的吸收波长、吸光值以及中位峰宽,并通过最大吸收峰波长计算出胶体金颗粒粒径的大小,利用透射电镜量出胶体金颗粒的平均直径,观察它的大小分布是否均一,最终选择合适的胶体金颗粒进行实验。胶体金金颗粒表面有一层生物大分子物质如蛋白,而表面的这层蛋白可以保护这些金颗粒,以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金颗粒对蛋白的吸附取决于pH值,这是因蛋白的静电荷取决于溶液的PH。我们在制备胶体金探针时,将胶体金的pH调整为PI+0.5,这样蛋白带正电,更有利于蛋白的结合。用最适体积的K2CO3调节胶体金溶液的pH,偶联不同体积的抗体蛋白,检测OD520nm/OD580nm 比值,作蛋白抗体体积-吸光度变化曲线,确定最适抗体蛋白所需量,当胶体金加入抗体蛋白偶联后利用透射电镜观察确定金颗粒已吸附蛋白并确定蛋白的最适用量,然后在胶体金溶液加入适量的抗体蛋白质,1小时后,再加入10%的BSA100ul,混匀30分钟12000r/min离心40分钟,用胶体金保存液重悬即获得胶体金探针。最后,对金标抗体溶液稳定剂及缓冲液进行优化比较,选择能有效保持金标溶液稳定性及活性的条件。3、三元金标结直肠癌快速筛查试剂盒的研制采用粪便脱落细胞学涂片法分析结直肠癌患者粪便脱落细胞的情况,将找到癌细胞的结直肠癌标本作为阳性标本,将正常人癌细胞阴性的粪便标本作为阴性对照标本。设计制备粪便脱落细胞收集检测试剂瓶:试剂瓶瓶口设计为广口,方便加入粪便样本,中央采用内芯管(内塞)封口及滴出样品,内芯管瓶内底部设置100目筛网分隔,用以过滤粪便中食物残渣;内芯管出口部设置300目筛网分隔,进一步过滤经第一次滤过后剩余的粪便残渣,内芯管外口用小胶盖密封。试剂瓶用外再用大胶盖封口,保证试剂瓶洁净卫生,方便使用。瓶内预装标本处理液,粪便标本采集后,将内芯管拔出,将样品加入瓶内,然后装入内芯管,拧紧内芯管,盖紧试剂瓶,摇匀标本,检测时打开内芯管胶盖,滴出样品到试剂盒检测槽内检测。将羊抗鼠IgG二抗、羊抗兔IgG二抗和PKM2小鼠单克隆抗体、CA19-9小鼠单克隆抗体及FOBT兔多克隆抗体一抗分别包被在硝酸纤维素膜质控线和检测线上,并经封闭液处理。将金标垫浸泡于胶体金-抗体复合物后,选择适合的条件进行干燥。然后将硝酸纤维素膜、吸水纸、金标垫以及样品垫依次粘贴至PVC底板上,组装好后按长6cm、宽0.4cm裁剪成试纸条。对PKM2、CA19-9及FOBT胶体金免疫层析试纸条的各项制备条件和指标进行优化。同时通过对阳性和阴性对照粪便检测试验结果的分析观察及IPP图像分析系统定量分析比较,以最优条件制备PKM2、CA19-9及FOBT检测试纸条。然后将三种试纸条组装成试剂盒中的主要成分检测板,将检测板、预装样品处理液的样本平及说明书组装成三元金标结直肠癌快速筛查试剂盒。4、三元金标结直肠癌快速筛查试剂盒在临床的应用收集正常人粪便标本32例、南方医院普通外科结直肠癌患者粪便标本170例。用粪便标本裂解液处理粪便标本,过滤,除去食物残渣,置4度冰箱保存备用。实验时将PKM2、CA19-9及FOBT胶体金免疫层析试纸条分别插入粪便样品悬液中,5分钟之内观察试纸条的显色结果。如免疫层析试纸条上检测线及质控线处各显示红色条带,则表示检测样品当中有待测抗原,则判为阳性;若仅在质控线上显示红色条带,则判为阴性;若质控线上不显示红色条带,则表示测试试纸条制作失败。将三种试纸条全部阳性的标本,判断为试剂盒检测阳性,否则,判断为阴性。然后我们根据试纸条/试剂盒的检测结果来分析试纸条/试剂盒的灵敏度、假阴性率(漏诊率)、假阳性率(误诊率)等效果评价指标,综合评价试纸条/试剂盒。显著性比较用χ 2检验,P<0.05认为差异有显著性意义。结果1、结直肠癌脱落细胞相关标志物PKM2在结直肠癌组织和细胞中的表达免疫蛋白印记(western bloting)检测PKM2在8株结直肠癌细胞株的表达,结果显示:PKM2在8株结直肠癌细胞株中均有不同程度的表达;免疫细胞化学及免疫荧光分析显示,PKM2主要在胞浆中表达。Western bloting分析PKM2在10例新鲜配对结直肠癌组织及癌旁正常肠粘膜组织的表达,结果显示:PKM2在结直肠癌组织中的表达明显高于配对正常粘膜组织。免疫组化结果显示:检测PKM2在正常肠粘膜组织中不表达或低表达,而在结直肠癌组织中则呈高表达。结果显示PKM2可用作结直肠癌的检测标志。2、胶体金-抗体复合物的合成根据肉眼观察胶体金的颜色,透明度、有无沉淀及漂浮物选择制备最佳的胶体金,用400-700nm进行紫外线分光光度仪扫描分析以柠檬酸三钠还原法获得的五种不同胶体金大小的粒径,获得的胶体金颗粒直径分别为34.09nm、10.68nm、10.68nm、12.74nm、36.15nm,透射电镜扫描结果显示胶体金颗粒大小较均一,且分散性较好,无多角形的金颗粒存在,无聚集现象。选择胶体金颗粒直径大小为12.74nm的胶体金作为后续实验用的标记胶体金颗粒。利用精密PH试纸判定胶体金的PH,测得单克隆抗体的PH值为8.2,多克隆抗体的PH值为7.5。通过紫外线分光光度仪检测OD520nm/OD580nmD的吸光度作曲线图确定制备胶体金抗体蛋白最佳体系为:每1ml胶体金溶液加入3ul 0.lmol/L K2CO3及4ug的PKM2、18ug的CA19-9以及5ug的FOBT的抗体蛋白。通过离心纯化胶体金抗体复合物,选择pH8.2 0.01mol/L硼酸(0.5%BSA,0.5%PEG20000,15%蔗糖,0.05%Tween-20)作为胶体金抗体复合物的缓冲液。3、三元金标结直肠癌快速筛查试剂盒的研制通过对试纸条的制作方法及制作过程进行检测优化,采用硝酸纤维素膜作为固相载体,确定硝酸纤维素膜的质控线最佳包被稀释浓度羊抗鼠为1:4、羊抗兔为1:8,检测线最佳包被抗体稀释浓度PKM2及CA19-9为1:4、FOBT为1:8,以1%牛血清白蛋白(BSA)封闭1h,室温干燥;在金标垫涂有胶体金-抗体结合物,室温干燥;用 0.0lmol/L pH8.2 硼酸,0.5%BSA,0.1%Tween-20,10%蔗糖处理样品垫;将硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫及吸收纸等组装结合成试纸条。通过上述最优条件分别制备出PKM2、CA19-9及FOBT检测试纸条。然后分别将PKM2、CA19-9及FOBT三种检测试纸条装入相互分隔便于加样和观察的胶盒内制成PKM2、CA19-9及FOBT三元金标结直肠癌筛查试剂盒检测板,稳定性检测表明该试剂盒可4℃保存4个月。将试剂盒检测板、含有样品处理液的试剂瓶及说明书包装组合包装,包装制成三元金标结直肠癌快速筛查试剂盒。4、三元金标结直肠癌快速筛查试剂盒在临床的应用用制备出的PKM2、CA19-9及FOBT检测试纸条检测32例正常人粪便标本、170例结直肠癌患者粪便标本。构建PKM2、CA19-9及FOBT检测试纸条并组装成试剂盒,采用试剂盒进行检测,结果显示:PKM2、CA19-9及FOBT检测试纸条其单独检测的灵敏度分别为80%、82.35%及75.29%;漏诊率分别为:20%、17.65%、24.7%;误诊率分别为:9.38%、12.5%、12.5%;试剂盒三项指标组合检测的灵敏度为62.35%,漏诊率为37.64%,误诊率为3.12%。试剂盒组合三项指标灵敏度下降,但能显著降低误诊率,可以临床推广应用。结论(1)本研究成功研制出PKM2、CA19-9及FOBT三元金标结直肠癌快速筛查试剂盒。用本试剂盒检测病人的粪便标本,可简便快速观察结果。(2)三元金标结直肠癌快速筛查试剂盒在结直肠癌筛查应用中有较高的灵敏度、特异度及较低的误诊率,适用于结直肠癌的筛查,并且便于高危人群自查,从而使结直肠癌能早期发现、早期得到诊断和治疗,减少结直肠癌的死亡率。