乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染与肝癌的发生具有十分密切的关系，HBV X蛋白(HBx)的反式激活作用在肝癌的发生发展中具有十分重要的作用，然而，目前还没有特异性的药物能够有效地抑制HBx的致癌功能。由于目前HBx的三维结构仍然不清楚，所以无法根据其三维结构设计特异性化学抑制剂。本研究通过克隆能与HBx特异性结合的蛋白的结合功能域基因，并使之在细胞中过表达出能与HBx特异性结合的肽段，从而达到抑制HBx致癌作用的目的。在保证肽段对细胞没有明显毒性的前提下，本研究主要利用稳定转染HBV X基因的人肝癌细胞系HepG2-X和稳定转染X基因的永生化人肝细胞系L-02-X对所克隆的多肽片段进行筛选。　　 主要内容如下：　　 一、HBx结合蛋白的结合功能域基因的克隆。　　 通过文献检索，利用生物信息学的方法，从HBx已知的结合蛋白中挑选出序列信息清楚，长度适于克隆，并且与其他蛋白交叉作用较少的五种蛋白作为备选，通过设计特异性的引物，将其与HBx的特异性结合区域的基因分别克隆入真核表达载体pCMV-Tag2B中，将其分别命名为pCMV-Tag2B—Peptide73，pCMV-Tag2B—Peptide43，pCMV—Tag2B—Peptide57，pCMV—Tag2B—Peptide120，pCMV—Tag2B—Peptide64。　　 二、抗HBx多肽的筛选。　　 由于五种肽段均属于细胞组成型表达的成分，为了检测其在细胞中过表达之后是否具有毒性，本实验将五种肽段瞬时转染入人肝癌细胞系HepG2中，通过流式细胞、Western Blot、BrdU掺入实验和报告基因四种检测手段证明，五种肽段对细胞无明显毒性。为了进一步检测该五种肽段在细胞中对HBx的抑制作用，本实验将克隆有五种肽段的真核表达载体瞬时转染入HepG2-X细胞中，并以转染pSi-X(HBV X基因的RNA干扰质粒)的实验组为阳性对照，通过流式细胞、Western Blot、BrdU掺入实验和报告基因的检测结果发现，Peptide120和Peptide64对HBx所导致的细胞高增殖能力和恶性表型具有明显的抑制作用。为了进一步验证Peptide120和Peptide64的功能，本实验在L-02-X和L-02细胞系中对部分实验进行了重复。结果表明，Peptide120和Peptide64对细胞无明显毒性，并且对HBx所导致的细胞高增殖能力和恶性表形具有明显的抑制作用。　　 三、表达Peptide120和Peptide64基因的腺相关病毒载体的分子克隆。　　 前期实验已证明，Peptide120和Peptide64在瞬时转染的细胞水平能够明显抑制HBx的致癌作用。为检测这两种多肽片段是否能够稳定且长期地在细胞和动物水平抑制HBx的致癌能力，并为今后多肽药物的开发做准备，本实验将Peptide120和Peptide64的基因克隆入腺相关病毒(AAV)载体，并拟将其导入细胞和荷瘤动物体内，观察其是否能够长期地抑制由HBx所导致的细胞恶性表形和成瘤能力。本实验已成功将Peptide120和Peptide64的基因克隆入AAV相关质粒载体中，并将其命名为pAAV-MCS-Peptide120和pAAV-MCS—Peptide64，后续实验仍在进行中。　　 综上所述，本研究发现Peptide120和Peptide64不仅毒性小，而且在细胞水平能够有效地抑制HBx的功能，降低细胞的增殖能力和恶性表形。此外，本研究提供了一种发现多肽抑制剂研究的新思路。