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背景和目的前期课题组运用酵母双杂交技术发现Par-4与hTERT有相互作用。Par-4有明确的促进肿瘤细胞凋亡的作用,且存在其特定的促进凋亡功能区域。那么hTERT与Par-4结合的区域是否为其特定的促进凋亡的区域呢?我们首先用分子生物膜层干涉技术检测Par-4和hTERT的直接结合区域。过表达TERT可以在胰岛β细胞中实现抗凋亡作用,但TERT抗凋亡的机制尚不清楚。Par-4与多种增龄性疾病相关,且Par-4可以通过线粒体途径诱导细胞凋亡。我们首先从细胞水平研究Par-4和TERT相互作用及其在胰岛β细胞凋亡中的作用机制。再进行体内实验,进一步探索TERT与Par-4相互作用参与2型糖尿病小鼠胰岛β细胞凋亡的机制。方法:1.根据hTERT的功能结构域,将hTERT分为4个片段,构建其四个缺失突变体。首先构建Par-4全长基因,待测出与hTERT有相互作用后,再根据Par-4的功能分区构建Par-4的3个缺失突变体。确定基因片段的位点后由德泰生物科技有限公司完成基因构建、合成和质检。hTERT四个缺失突变体、Par-4全长、Par-4三个缺失突变体蛋白在大肠杆菌系统中表达与纯化;成功后再进行蛋白的鉴定。使用分子生物膜层干涉技术检测蛋白与蛋白直接相互作用;Par-4全长蛋白分别与hTERT四个缺失突变体检测,仅hTERT-2能够与Par-4结合,再进行hTERT-2蛋白与Par-4的三个缺失突变体相互作用检测。2.NIT-1细胞首先分为C组(正常组)、H12组(高糖高脂DMEM培养基培养12小时)、H24组(高糖高脂DMEM培养基培养24小时)、H48组(高糖高脂DMEM培养基培养48小时)。然后再把细胞分为C组(正常空病毒对照组)、H组(高糖高脂组)、C-Par-4组(正常+Par-4抑制组)、H-Par-4组(高糖高脂+Par-4抑制组);CS组(SH5抑制组)、HS组(高糖高脂+SH5抑制组)、CS-Par-4组(SH5抑制+Par-4抑制组)、HS-Par-4组(高糖高脂+SH5抑制+Par-4抑制组)。MTT检测各组细胞存活率;TUNEL染色检测各组细胞凋亡情况;ELISA检测胰岛素分泌情况;免疫细胞化学、Western blot检测Par-4、TERT、Akt、p-Akt蛋白表达情况;免疫共沉淀和免疫荧光检测Par-4与TERT的表达情况。3.实验动物分组为N组(对照组)、D组(2型糖尿病小鼠)、N-Par-4组(正常饮食的Par-4基因敲除小鼠)、D-Par-4组(Par-4基因敲除的糖尿病小鼠);每只动物每天都会测量体重和尾静脉血糖值。在实验结束时,摘除胰腺并保存在-80℃。ELISA试剂盒测定小鼠血清的Par-4和胰岛素水平;Western blot和免疫组化检测Par-4、TERT、Akt、p-Akt蛋白表达;TUNEL染色测胰腺组织细胞凋亡率。结果:1.完成hTERT四个缺失突变体、Par-4全长及其三个缺失突变体的蛋白在大肠杆菌系统中表达与纯化以及鉴定。Par-4蛋白与hTERT-1(1-183aa)、hTERT-3(523-924aa)和hTERT-4(915-1132aa)蛋白无直接相互作用。Par-4与5个不同浓度的hTERT-2(170-546aa)蛋白均有直接相互作用。hTERT-2蛋白与Par-4(1-299aa)、Par-4(1-160aa)和Par-4(161-340aa)蛋白有直接相互作用。2.随着处理时间的延长,高糖高脂48小时组与细胞处理时间更短组以及对照组细胞相比Par-4表达和细胞凋亡率显著增加(p<0.05)。此外,高糖高脂48小时组与细胞处理时间更短组及对照组细胞相比TERT表达、存活率和胰岛素分泌显著下降(p<0.05)。正常细胞中抑制Par-4,不会造成TERT表达、细胞增殖能力、凋亡率和胰岛素分泌能力的变化(P>0.05)。高糖高脂干预可以增加胞浆Par-4水平和凋亡率,降低胞浆TERT水平、细胞生存率和胰岛素分泌能力。当在高糖高脂条件下抑制Par-4可以增加胞浆TERT水平、增加细胞存活率、增加胰岛素分泌(P<0.05)。免疫共沉淀和免疫荧光检测结果提示Par-4和TERT在胞浆相互作用,Par-4可以抑制TERT的表达。高糖高脂处理导致Par-4表达增加,抑制TERT表达和增加凋亡。相反,在高糖高脂环境下减少Par-4表达,可以增加TERT表达,抑制凋亡。正常细胞中抑制Akt活性,不会造成胰岛β细胞凋亡率的变化。高糖/高脂干预后可导致Par-4表达上升,Akt、p-Akt表达减少,细胞存活率下降,最终导致胰岛素分泌降低和NIT-1细胞凋亡增加,抑制Par-4可缓解以上过程。抑制p-Akt表达后,细胞凋亡增加。说明Par-4可以通过Akt/p-Akt信号途径诱导胰岛β细胞凋亡和胰岛素分泌功能的改变。3.N组和N-Par-4组凋亡率和胰岛素分泌无差异,说明在正常小鼠中敲除Par-4,不会影响凋亡率和胰岛素分泌。D组的凋亡率较N组明显升高,胰岛素分泌和HOMA-β指数显著降低。D组与D-Par-4组比较,D组凋亡率更高,胰岛素分泌量更少,HOMA-β更低,提示Par-4在糖尿病小鼠体内有促进胰岛β细胞凋亡的功能。免疫组化和Western blot显示2型糖尿病小鼠胰岛β细胞Par-4表达增多,TERT、Akt和p-Akt蛋白表达下降,导致凋亡率增加和胰岛素分泌减少。阻断Par-4表达可升高TERT、Akt和p-Akt蛋白表达,改善凋亡和胰岛素分泌功能不全。结论1.Par-4全长和三个缺失突变体均与hTERT-2(170-546aa)直接结合,我们推测Par-4至少有两个位点会与hTERT-2(170-546aa)直接结合。因此Par-4与hTERT的结合位点为NLS和除NLS2以外的SAC或LZ区域。2.Par-4的表达与高糖高脂处理和凋亡率呈正相关,与TERT表达、生存率和胰岛素分泌呈负相关;而且,这些影响与时间有关。因此,选择48h作为最佳处理时间。高糖高脂通过上调Par-4表达,下调TERT表达,诱导胰岛β细胞凋亡。Par-4与TERT相互作用,在高糖高脂培养的NIT-1细胞中观察到其在胞浆抑制TERT表达,可能触发Par-4向细胞核转位。糖尿病激活Par-4并通过抑制p-Akt表达诱导胰岛β细胞凋亡。3.Par-4在糖尿病小鼠体内有促进胰岛β细胞凋亡的功能。2型糖尿病小鼠胰岛β细胞Par-4表达和分泌增多,TERT、Akt和p-Akt蛋白表达下降,导致胰岛β细胞凋亡率增加和胰岛素分泌减少。阻断Par-4表达可升高TERT、Akt和p-Akt蛋白表达,改善胰岛β细胞凋亡和胰岛素分泌功能不全。